To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
METODY ELEKTROFORETYCZNE
Elektroforeza - wędrówka jonów w polu elektrycznym i proces rozdzielania tych cząsteczek wskutek różnicy szybkości ich migracji.
Zastosowanie elektroforezy - analiza i oczyszczanie makrocząsteczek/białek/kwasów nukleinowych oraz cukrów, aminokwasów, peptydów, nukleotydów, jonów i in.
Szybkość poruszania się cząstki w polu elektrycznym: υ =μ E gdzie: υ [cm/s] - szybkość migracji μ [m 2 /s V] - ruchliwość elektroforetyczna E [V/m] - natężenie pola elektrycznego, Wpływ parametrów środowiska: Ruchliwość elektroforetyczna (μ) jest charakterystyczna dla danego jonu i jest wprost proporcjonalna do jego ładunku q [C], i odwrotnie prop orcjonalna do promienia r [pm] Podział metod elektroforetycznych:
Elektroforeza swobodna
Elektroforeza w nośnikach:
bibułowa
żelowa [agarozowy, PAGE]
Etapy elektroforezy:
przygotowanie próbki
wybór odpowiedniego nośnika i systemu buforów elektroforetycznych
rozdział elektroforetyczny
detekcja
ELEKTROFOREZA BIBUŁOWA:
Nośnik: bibuła chromatograficzna, octan celulozy
Technika kombinowana: elektrochromatografia
ELEKTROFOREZA NA ŻELACH AGAROZOWYCH:
Są to galaretki półprzezroczyste, kruche, nie są tak odporne jak żele poliakrylamidowe
Ich głównym składnikiem jest agaroza
Stosowana w biologii molekularnej do analizy kwasów nukleinowych
Immunoelektroforeza białek
Elektroforeza kwasów nukleinowych na żelach agarozowych: Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą na rozdzielenie, identyfikacje lub oczyszczenie fragmentów DNA.
Technika horyzontalna - rozdział według rozmiaru cząsteczek
Żele agarozowe o różnym stężeniu stosuje się do rozdziału fragmentów DNA od 200 pz do 50 000 pz
Detekcja kwasów nukleinowych w agarozie:
Barwniki fluerescencyjne - np. lub bromek etydyny pozwalają na uwidocznienie makrocząsteczek po zakończeniu elektroforezy lub wybarwienie przed separacją. Znaczniki uwidaczniają położenie prążków w świetle UV lub widzialnym. Czułość detekcji jest porównywalna z barwieniem srebrem lub jest nieco lepsza.
IMMUNOELEKTROFOREZA BIAŁEK NA ŻELACH AGAROZOWYCH:
Metody wykorzystujące swoiste reakcje Ag-Ig
(…)
… azotanem srebra
Odbarwianie tła
ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM:
Elektroforeza natywna - Metoda Ornstein'a - Davis'a
ruchliwość elektroforetyczna jest uzależniona od ładunku i rozmiaru cząsteczki
układ nieciągły, niedenaturujący
Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS, mocznik) + reduktor (β-merkaptoetanol, DTT) Rozdział na zasadzie sita molekularnego
Metoda Laemmli'ego: bufor elektrodowy: Tris-glicyna
Metoda Shagerravona: bufor elektrodowy: Tris-tricyna
Jest możliwe wyznaczanie masy cząsteczkowej białka:
M - masa cząsteczkowa białka
Metody detekcji stosowane w żelowej elektroforezie:
Coomasie Brilliant Blue (0,1-1µg)
sole cynku (10-100 ng)
sole srebra (1-10 ng) SYPRO orange (2-10 ng)
Selektywne wybarwianie enzymów (wizualizacja enzymów, które w wyniku katalizy produkują barwny…
… od specyficznych reakcji antygen-przeciwciało i służy do detekcji rozdzielonych białek. Po niskonapięciowej elektroforezie próbek na żelu agarozowym wprowadza się surowice odpornościowe, które dyfundują przez żel i tworzą widoczne osady z rozdzielonymi antygenami.
Elektroforeza na ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM:
polimer akrylamidu i bisakrylamidu (czynnik sieciujący)
posiada wysoką zdolność rozdzielczą
odporny…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)