To tylko jedna z 2 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Elektroforeza
Jedna z podstawowych technik frakcjonowania cząsteczek obdarzonych ładunkiem elektrycznym (białka, peptydy, kwady nukleinowe, komórki). Podstawa innych technik m.in. hybrydyzacji, sekwencjonowania, PCR.
Rozdział cząsteczek w polu elektrycznym, migrują do przeciwnie naładowanej elektrody. Prędkość zależna od wielkości molekuły, ładunku (proporcjonalna do natężenia pola, a odwrotnie proporcjonalna do masy). Szybkość i9 jakość rozdziału zależy m.in. od rodzaju buforu, natężenia pola oraz rodzaju nośnika (np. żele agarozowe, PAA- poliakrylamid o zmiennym stężeniu). Nośniki muszą być neutralne chemicznie wobec rozdzielanych substancji.
Wybór rodzaju elektroforezy zależy od charakteru i przeznaczenia analizowanej próbki (np. żele analityczne, preparatywne). W przypadku białek (niekiedy DNA) stosuje się jako dodatek do wymienionych żeli- SDS (powoduje zniszczenie struktur III i IV rzędowej białke oraz zapobiega ich agregacji (żele denaturujące), związek o podobnych właściwościach to mocznik.
SDS i merkaptoetanol- dodawany do żeli. Rola w elektroforezie białek:
SDS nadaje całemu białku taki sam ładunek elektryczny
ME- niszczy mostki disiarczkowe i można ocenić z ilu łańcuchów składało się białko.
Żele agarozowe- poziome
Akrylamidowe- pionowe
Błękit kumaryny- barwnik
Typy rozdziałów elektroforetycznych:
Elektroforezy standardowe mają charakter rozdziałów jednokierunkowych. Istnieje też wersja dwukierunkowa. W pierwszym kierunku stosuje się zwykle ogniskowanie izoelektryczne (rozdział na podstawie wielkości ładunku jakim obdarzone jest białko), po czym rozdzielone frakcje ustawia się prostopadle do pierwotnego rozdziału i następuje rozdział w drugim kierunku (na podstawie różnic w masie cząsteczkowej -2D-PAGE)
Każda plamka uzyskana podczas takiego rozdziału (inaczej niż paseczki w elektroforezie jednokierunkowej) odpowiada pojedynczemu białku w analizowanej próbce. Metoda pozwala na równoległy rozdział wielu białek. Oba typy rozdziałów białek mogą być wykorzystywane do analiz jakościowych, ilościowych i kontroli czystości preparatów.
2D-PAGE- dwukierunkowa elektroforeza w PAA:
Finalny efekt- plamka odpowiadająca pojedynczemu białku obecnemu w wyjściowej mieszaninie. Jej wielkość i intensywność odpowiada % zawartości konkretnego białka w analizowanej próbie. Równoczesny rozdział wielu białek daje znacznie lepszy rezultat niż przy zastosowaniu tradycyjnej (jednokierunkowej) elektroforezy.
Zastosowanie: analizy proteomu, wykrywanie markerów enzymatycznych, ocena czystości białka.
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)