Elektroforeza białek na żelu poliakrylamidowym w układzie Laemmli'ego

Nr grupy: 3
Klaudia Wawrzyniak Dr Barbara Mickowksa
17.12.2012
Elektroforeza białek na żelu poliakry la midowym w układzie Laemmli'ego 09.01.2013
1.Wstęp teoretyczny:
Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym jest najczęściej stosowana do rozdziału białek. Może być ona przeprowadzona w układzie denaturującym, gdzie żel i/lub bufor zawierają związki denaturujące takie jak SDS (dodecylosiarczan sodowy) i mocznik. Do analizowanych próbek, w celu zniszczenia mostków siarczkowych dodaje się także czynniki redukujące np. 2-merkaptoetanol, uzyskuję się w ten sposób rozłożone pojedyncze łańcuchy polipeptydowe. SDS rozwija łańcuchy białek i mocno się z nimi wiąże, w stałym stosunku wagowym 1,4g SDS / 1g białka. Każda cząsteczka SDS ma ładunek ujemny, a ich ogromna ilość przyłączająca się do łańcuchów polipeptydowych nadaje im ładunek ujemny.Z racji jednakowego ładunku jaki nadaje cząsteczkom SDS rozdział białek techniką SDS-PAGE zachodzi jedynie w wyniku sączenia molekularnego przez pory w żelu i zależy tylko od masy cząsteczek. W układzie Laemmli'ego stosuje się dwa żele o różnej porowatości : szerokoporowaty żel zagęszczający poprzedza zasadniczy żel rodzielający. W pierwszym etapie następuje zagęszczenie nałożonej mieszaniny białek. Zależność pomiędzy ruchliwością białek a logarytmem z mas cząsteczek jest liniowa w pewnym zakresie mas cząsteczkowych. Znając więc odległość migracji badanego białka można wyznaczyć jego masę.
2. Cel ćwiczenia: Zastosowanie elektroforezy w warunkach denaturujących i redukujących do wyznaczania masy cząsteczkowej białek.
3. Przebieg ćwiczenia:
Skład żelu rozdzielającego:
dH 2 O
3,35 ml
1.5 M Tris-HCl pH 8.8
2,50 ml
10% SDS
0,10 ml
akrylamid/Bis-akrylamid 30% (29,2 g akrylamid + 0.8 g bisakrylamid/100 ml)
4,00 ml
10% APS (nadsiarczan amonu)
50 μl
TEMED
5 μl
Skład żelu zagęszczającego:
dH 2 O
3,06 ml
0.5 M Tris-HCl pH 6.8
1,26 ml
10% SDS
50 μl
akrylamid/Bis-akrylamid 30% (29,2 g akrylamid + 0.8 g bisakrylamid/100 ml)
0,76 ml
10% APS (nadsiarczan amonu)
30 μl
TEMED
3 μl
Skład buforu do próbek:
0.5 M Tris-HCl pH 6.8
0,25 ml
10% SDS
0,4 ml
glicerol
0,2 ml
2-merkaptoetanol
0,1 ml
Bromophenol Blue
Do lekko niebieskiego zabarwienia
Skład buforu elektrodowego:
0,025 M Tris, 0,192 M glicyna, 0,1% SDS.
Sporządzono próbki albuminy dodając kolejno 5,10,15,20 µl roztworu albuminy i mieszając je w stosunku 1:1 z buforem do próbek. Analogicznie postąpiono z roztworem markerów mas cząsteczkowych białek i analizowaną próbką białek. Następnie włożono wszystkie próbki do termobloku (97,5°C) na pięć minut. Tak przygotowane próbki wstrzyknięto do studzienek w założonym już żelu.

(…)

… przy pomiarze odległości, a także niedostatecznej dokładności urządzenia mierzącego (linijki), przyczyną może być również źle dobrany żel (o złej porowatości). Jednak w miarę zmniejszania się masy cząsteczek metoda jest coraz bardziej dokładna, bo dla ruchliwości względnej równej 0,717, masa białka markerowego wyniosła tyle samo co masa oznaczanego białka (tabela 4), a odległości ich wędrówki były identyczne…
... zobacz całą notatkę