DNA
Preparat DNA może być przechowywany
- w temp. Pokojowej przez krótki czas
- w temp. 4°C po dodaniu chlorofilu (5μl chloroformu/ 1ml DNA) przez długi okres czasu
- w stanie zamrożenia przez nie ograniczony czas
Przygotowanie materiału roślinnego do analizy DNA:
1.Sterylizować po 5 ziarniaków w 1,6% podchlorynie sodu przez 2 min
2. Wysterylizowane ziarniaki przenieść do czystej wody destylowanej i płukać przez 5 minut
3. Płukanie powtórzyć trzykrotnie
4. Wysterylizowane ziarniaki przenieść na szalki Petriego wyłożone wilgotną sterylna bibułą
5. Szalki przenieść do kiełkownika (25°C ) na 3 dni.
Izolacja DNA
1 Kilkudniowe skrawki liści umieścić w próbówkach Eppendorfa i homogenizować w ciekłym azocie za pomocą moździerzników z tworzywa sztucznego , po czym dokonać lizy komórek w obecności 400 μl buforu ekstrakcyjnego
2 Próby umieścić w łaźni wodnej o temp. 65°C na 20 minut . Następie dodać 200 μl 5M octanu potasu, worteksować i inkubować przez 10 minut na lodzie, po czym wirować przez 15 min. , przy 13000RPM.
3 Przenieść 500 μl supernatantu do świeżych probówek Eppendorf, dodać 1ml 95% etanolu i wytrącać DNA w temp -20°C przez 20 min. Następnie wirować próby przy 13000 RPM przez 15 min.
4 Uzyskany osad przemyć 70 % etanolem po czym zawiesić w 200μl buforu TE.
Wybór metody izolacji DNA
- rodzaj komórek lub tkanek z których izolowane będzie DNA
- rodzaj izolowanego DNA (całkowite, chromosomalne, mitochondrialne, chloroplastydowe, plazmidowe)
- czystość i jakość DNA niezbędna do dalszych analiz
- wymagana ilość DNA
Wszystkie techniki izolacji DNA opieraja się na dezintegracji (rozbiciu) komórek i oddzieleniu DNA od struktur komórkowych związanych z nim białek i cząstek RNA
Etapy izolacji DNA
-Dezintegracja tkanek
-Niszczenie membran komórkowych
-Ekstrakcja DNA
-oczyszczanie
-precypitacja
-płukanie
-suszenie peletu
-zawieszenie w wodzie z RNazą
-przechowanie
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)