To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
TEST TRANSFORMACJI BLASTYCZNEJ LIMFOCYTÓW
TRANSFORMACJA BLASYCZNA LIMFOCYTÓW - jest to zjawisko polegające na przechodzeniu limfocytów dojrzałych w formy niedojrzałe (blasty) pod wpływem stymulacji swoistej lub nieswoistej.
W warunkach in vivo proliferację limfocytów T i B wywołują antygeny, a w warunkach in vitro transformację blastyczną limfocytów można wywołać antygenem lub nieswoistymi czynnikami mitogennymi, czyli lektynami.
W teście transformacji blastycznej limfocytów najczęściej używanymi antygenami są:
oczyszczona tuberkulina (PPD)
anatoksyna tężcowa
anatoksyna błonicza
lipopolisacharyd bakteryjny (LPS)
surowice antylimfocytarne i antyimmunoglobulinowe
Spośród lektyn najczęściej stosuje się:
fitohemaglutyninę (PHA)
konkanawalinę A (Con A)
mitogen szkarłatki (PWM)
Fitohemaglutynina i konkanawalina A wywołują proliferację limfocytów T, a nie limfocytów B, ale w zawiesinie komórkowej zawierającej obie subpopulacje limfocytów wywołują proliferację obu typów komórek. Mitogen szkarłatki powoduje transformację głównie limfocytów B.
zastosowanie: ocena funkcji limfocytów T i B, określenie ogólnego stanu czynnościowego limfocytów oraz wykrywanie ogólnych defektów układu immunologicznego zależnych od wad jego komórek
wykonanie: zawiesinę izolowanej frakcji limfocytów w odpowiednim środowisku hodowlanym inkubuje się w obecności lektyny (w stężeniu optymalnym dla wywołania proliferacji) - hodowlę prowadzi się albo w probówkach, albo na mikropłytkach hodowlanych w warunkach jałowych w inkubatorze z nawiewem 5% CO2 w temperaturze 37°C; równolegle w tych samych warunkach prowadzi się hodowle kontrolne danych limfocytów bez czynnika mitogennego; po inkubacji (zwykle 1-8 dniowej) ocenia się wynik na podstawie odsetka komórek transformujących; ocenę transformacji blastycznej limfocytów można przeprowadzić metodą morfologiczną lub izotopową:
metoda morfologiczna - z osadu hodowli komórek stymulowanych mitogenem wykonuje się rozmaz i barwi go metodą Pappenheima; gotowe preparaty ogląda się w mikroskopie, oceniając cechy morfologiczne komórek (komórki blastyczne są 2-4-krotnie większe od limfocytu i mają duże dobrze wyodrębnione jądro o luźnej strukturze chromatynowej); w każdym preparacie ocenia się liczbę komórek blastycznych przypadających na 500 lub 1000 kolejnych komórek i oblicza indeks blastyczny wg wzoru: x = a/b × 100%, gdzie x - indeks blastyczny w %, a - liczba blastów przypadająca na 500 lub 1000 kolejnych komórek, b - liczba komórek limfatycznych oceniona w preparacie (w preparacie z hodowli komórek nie stymulowanych odsetek komórek blastycznych nie powinien przekroczyć 7%)
(…)
… lub 1000 kolejnych komórek, b - liczba komórek limfatycznych oceniona w preparacie (w preparacie z hodowli komórek nie stymulowanych odsetek komórek blastycznych nie powinien przekroczyć 7%)
metoda izotopowa - jest czulsza i dokładniejsza; oparta na pomiarze inkorporacji (wbudowania) radioaktywnie znakowanych prekursorów kwasów nukleinowych (najczęściej tymidyny) lub znakowanych prekursorów białek (najczęściej leucyny); ilość wbudowanych prekursorów można oznaczyć poprzez pomiar radioaktywności; liczbę komórek, które wbudowały znakowany prekursor, można też określić metodą autoradiografii
wykonanie: zawiesinę limfocytów w odpowiednim środowisku z dodatkiem czynnika mitogennego umieszcza się w inkubatorze z dopływem CO2 i hoduje przez 3-4 doby; równolegle prowadzi się hodowlę danych limfocytów bez…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)