Spektrofotometryczne wyznaczanie stężenia jednego składnika.

Nr grupy: III Imiona i nazwiska studentów: Beata Wojdak
Nazwisko prowadzącego: Dr Barbara Mickowska Data wykonania ćwiczenia: 15.10.12 Tytuł ćwiczenia: Spektrofotometryczne wyznaczanie stężenia jednego składnika.
Data oddania sprawozdania: 5.11.12 Zalic zenia/ ocena: 1. Wstęp teoretyczny: Oznaczanie pojedynczego składnika, selektywnie absorbującego światło o określonej długości fali prowadzi się przy odpowiadającej maksimum absorpcji. Pomiary polegają na porównaniu natężenia wiązki promieniowania przechodzącego przez badaną próbkę oraz próbkę odniesienia (np. rozpuszczalnik). Do oznaczeń można wykorzystywać również produkty powstające w wyniku reakcji chemicznych badanego związku z odpowiednim odczynnikiem (specyficzność i ilościowość reakcji, trwałość produktu). Zależność między wynikiem pomiaru a zawartością oznaczanego składnika ustala się za pomocą próbek wzorcowych. Metoda krzywej kalibracyjnej polega na sporządzeniu serii wzorców o składzie naśladującym próbkę badaną, o zakresie stężeń pokrywającym cały przedział analityczny. Na podstawie pomiarów sporządza się wykres zależności mierzonej wielkości fizycznej od stężenia substancji, co umożliwia określenie stężenia substancji w badanej próbce.
Metoda opiera się na połączeniu reakcji biuretowej oraz reakcji Folina-Ciocalteu. Wiązania peptydowe białek reagują z jonami miedzi w warunkach alkalicznych, tworząc kompleks, a drugą reakcją jest redukcja kwasów fosforowolframowego i fosforomolibdenowego (odczynnik Folina-Ciocalteu) do odpowiednich tlenków przez oksydację aminokwasów aromatycznych [tyrozyna, tryptofan] katalizowaną przez jony Cu + związane z białkiem. Powstające produkty reakcji mają intensywną niebieską barwę.
Cel ćwiczenia: Oznaczenie stężenia białka metodą Lowry'ego.
Przebieg ćwiczenia: Sporządzono serię wzorcowych roztworów białka [albuminy surowicy wołowej = BSA] o stężeniach 0,2 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,8 mg/ml i 1,0 mg/ml oraz próbę odczynnikową. Następnie przygotowano trzy razy próbkę badaną o nieznanym stężeniu (X 1 , X 2 i X 3 ). Do 0,1 ml wszystkich próbek dodano 0,1 ml roztworu 1M NaOH, następnie 1 ml roztworu węglan-winian-CuSO 4 i wymieszano. Po 15 minutach dodano 0.1 ml odczynnika Folina-Ciocalteu i wstrząsano energicznie [reagent Folina-Ciocalteu jest nietrwały w środowisku zasadowym]. Następnie odstawiono na 30 minut. Po tym czasie zmierzono absorbancję wszystkich próbek względem próby odczynnikowej przy λ=500 nm.
Odczynniki: -0,1 ml 1M NaOH
-1 ml węglan-winian-CuSO 4 -0,1 ml odczynnika Folina-Ciocalteu
Aparatura: ... zobacz całą notatkę