Analiza chemiczna biomolekuł ĆWICZENIA LABORATORYJNE S P R A W O Z D A N I E Z Ć W I C Z E N I A IMIĘ I NAZWISKO: TEMAT: DATA: 13.12.2012r. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradforta. CEL ĆWICZENIA: Poznanie procedury oznaczania stężenia białek wykorzystującej zjawisko tworzenia się kompleksu pomiędzy barwnikiem (Brilliant Blue G) a białkami. Pomiar absorbancji kompleksu białko-barwnik. ZASADA WYKONANIA ĆWICZENIA: Wzorzec białka – albumina bydlęca (1 mg/ml). Białka oznaczane – albuminy, globuliny. Do 10 ml lekko ogrzanego mleka dodano 4 ml 1% kwasu octowego. W celu uzyskania klarownego roztworu, osad wytrąconych białek odwirowano trzykrotnie po 5 min. Supernatant został wykorzystany do ilościowego oznaczenia sumarycznych zawartości globulin i albumin w mleku. Roztwór wzorcowy białka rozcieńczono w taki sposób aby, otrzymać po 0,1 ml rozcieńczonych roztworów wzorca o stężeniach: 0, 0.25, 0.50, 0.75, 1 mg/ml. W grupie przygotowano roztwór wzorcowy (1 ml odczynnika Bradforda +1 ml wody destylowanej). W 6 probówkach umieszczono po 1 ml odczynnika Bradforda, do czterech z nich dodano po 0,1 ml roztworu białka o określonym stężeniu, do dwóch pozostałych po 0,1 ml roztworu o szukanym stężeniu. Zawartość probówek wymieszano i odstawiono na 10 minut. Po inkubacji zmierzyłyśmy absorbancje próbek przy λ=595nm. Nr próbki Objętość odczynnika Bradforda [1 ml] Objętość roztworu białka [ml] Stężenie roztworu białka [mg/ml] Objętość roztworu wzorcowego [µl] Objętość wody destylowanej [µl] Absorbancja 1 1 0,1 (woda destylowana) 0 0 100 0 2 1 0,1 (roztwór wzorca) 0,25 25 75 0,653 3 1 0,1 (roztwór wzorca) 0,5 50 50 0,839 4 1 0,1 (roztwór wzorca) 0,75 75 25 0,951 5 1 0,1 (roztwór wzorca) 1 100 0 1,025 6 1 0,1 (nieznana próbka) X 0 0 0,917 7 1 0,1 (nieznana próbka) X 0 0 0,965 Absorbancja nieznanej próbki (średnia z dwóch pomiarów): 0,941 Z równania krzywej wyznaczam stężenie białka nieznanej próbki. 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75 0,8 0,85 0,9 0,95 1 1,05 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000 1,100 0,653 0,839 0,951 1,025 f(x) = 0,49x + 0,56 Krzywa wzorcowa Stężenie roztworu białka [mg/ml] A b s o rb a n cj a Y= 0,49x + 0,56 A= 0,941 0,941= 0,49x + 0,56 0,941 – 0,56 = 0,49x 0,381=0,49x / 0,49
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)