To tylko jedna z 2 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Oznacznie sekwencji aminokwasów w peptydach Etapy prowadzące do zsekwencjonowania białek 1. Przygotowanie białka do sekwencjonowania • Ustalenie liczby chemicznie róŜnych polipeptydów • Rozbicie wiązań kowalencyjnych i niekowalencyjnych -wiązania niekowalencyjne: czynniki denaturujące (mocznik, chlorowodorek guanidyny) - wiązania kowalencyjne (mostki S-S): redukcja związkami tiolowymi (ditiotreitiol,β
-merkaptoetanol) i alkilacja jodooctanem do stabilnych pochodnych S- karboksymetylowych • Rozdzielanie i oczyszczanie podjednostek 2. Ustalenie sekwencji aminokwasowej kaŜdego polipeptydu Sekwencjonowanie białek 1. Jaki jest skład aminokwasowy? - hydroliza kwaśna lub zasadowa 2. Który aminokwas jest na N-końcu? - odczynnik Sanger'a 3. Który aminokwas jest na C-końcu? - karboksypeptydazy 4. Jaka jest sekwencja? - degradacja Edmana 5. Fragmentacja białka - chemiczna lub enzymatyczna 6. Łączenie fragmentów Sekwencjonowanie: krok pierwszy - Ustalenie składu aminokwasowego 1. Hydroliza kwaśna lub zasadowa Kwaśna hydroliza 6 M HCl, temp. 110o C, przez 24-96 godz., w próŜni lub w atmosferze argonu; niszczy Trp, częściowo niszczy Ser, Thr, and Tyr, deaminacja Gln i Asn do Glu i Asp Zasadowa hydroliza 2-4 M NaOH, temp. 100oC , przez 4-8 godz.; niszczy Cys, Ser, Thr, Arg, ale nie uszkadza Trp 2. Rozdział mieszaniny aminokwasów - automatyczna chromatografia jonowymienna lub HPLC Chromatografia jonowymienna - Rozdział na kolumnie wypełnionej formą Na+ sulfonowanej żywicy polistyrenowej (Dowex-50). - Wiązanie kwaśnych AA (rozdział w pH 2) z jonem Na+ wymieniacza kationowego. Do wymywania stosuje się bufory cytrynianu sodu o wzrastającym pH. - Identyfikacja aminokwasu na podstawie pozycji wypływu (objętości buforu potrzebnej do wymycia AA z kolumny) przez porównanie z obrazem chromatograficznym standardowej mieszaniny AA. 3. Ilościowe oznaczanie aminokwasów - metoda ninhydrynowa (czułość 1 mg) lub reakcja z fluoreskaminą (czułość 1 ng, powstaje fluoryzujący produkt na skutek reakcji z grupą α
-aminową aminokwasu) Skład aminokwasowy ujawnia strukturę białka • Leu, Ala, Gly, Ser, Val, Glu, i Ile są najbardziej powszechnymi aminokwasami • His, Met, Cys, i Trp są najrzadziej spotykane • stosunek polarnych do niepolarnych aminokwasów wskazuje na globularne lub błonowe białka • pewne białka strukturalne utworzone są z powtarzających się peptydowych struktur np. kolagen Sekwencjonowanie: krok drugi -
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)