Oznaczanie grup sulfhydrylowych i mostków di siarczkowych w niskocząsteczkowym di siarczku- laboratorium

Laboratorium biochemii
Oznaczanie grup sulfhydrylowych i mostków di siarczkowych w niskocząsteczkowym di siarczku (ćw. D)
Cel ćwiczenia
Zapoznanie się z metodą oznaczania ilości mostków di siarczkowych i wolnych grup sulfhydrylowych w próbce o nieznanym stężeniu niskocząsteczkowego di siarczku.
Odczynniki
Bufor (0.1 M fosforan, 2mM EDTA) o pH 8.0
Borowodorek sodu NaBH4 - naważka 125 mg
1 M roztwór KH2PO4 w 0.1 M buforze fosforanowym, 2 mM EDTA o pH 8.0
Roztwór di siarczku w 0.1 M buforze fosforanowym, 2 mM EDTA o pH 8.0
10 mM roztwór kwasu 5,5'-ditriobis-2-nitrobenzoesowego (DTNB) w 0.1 M buforze fosforanowym, 2 mM EDTA o pH 8.0
Aceton
Azot gazowy (N2) Szkło i aparatura
Probówki kalibrowane
Probówki chemiczne
Pipety automatyczne oraz tipsy
Pipeta pasterowska do przepuszczania azotu gazowego
Parafilm
Kuwety
Specol
Termostat nastawiony na 37ºC
Wykonanie ćwiczenia
Oznaczanie ilości wolnych grup tiolowych przed redukcją w otrzymanej próbce disiarczku
Przygotowano 2 czyste, suche probówki i oznaczono je jako S, O; (S- disiarczek, O-odnośnik),
Do probówki „O” wlano 2 ml 0.1M buforu fosforanowego zawierającego 2mM EDTA o pH 8.0,
Do probówki „S” wlano 1ml 0.1M buforu fosforanowego, 2mM EDTA, pH 8.0 oraz 1ml badanego roztworu di siarczku,
Obydwie probówki zamknięto parafilmem, zawartość wymieszano przez inwersję probówek,
Do obu probówek dodano po 0.1 ml 0.01 M roztworu kwasu DTNB. Probówki wymieszano przez inwersję,
Reakcję prowadzono w temp. pokojowej przez 5min
Wyzerowano aparat względem odnośnika przy 412 nm. Zmierzono absorbancję próby badanej. Wyniki zanotowano w Tabeli 1.
Postępowanie powtórzono.
Redukcja disiarczku do wolnych grup tiolowych oraz oznaczanie ilości wolnych grup tiolowych po redukcji disiarczku
Przygotowano 3 czyste, suche probówki kalibrowane i podpisano jako S1, S2, O
Do probówek S1 i S2 dodano po 1ml roztworu disiarczku,
Do próbki O dodano 1ml buforu fosforanowego zawierającego 2mM EDTA, pH 8.0,
Przygotowano 2.5% roztwór NaBH4 poprzez rozpuszczenie naważki NaBH4 w wodzie destylowanej (obliczenia poniżej),
Do roztworów S1,S2,O dodano po 1ml 2.5% roztworu NaBH4,
Wszystkie roztwory uzupełniono wodą destylowaną do 4 ml i dokładnie wymieszano,
Roztwory inkubowano w łaźni wodnej (37ºC) przez 30 min,

(…)

… A412
II pomiar A412
Aśr412
ΔAśr412
CTNB- [M]
CpSH [M]
0,005
0,002
0,0035
0,1905
2,5735 E-7
5,4044 E-7
Tabela 2. Próbka
A412
Aśr412
Błąd [%]
CTNB- [M]
CredSH [M]
Css [M]
S1
0,189
0,194
2,6
0,000014
0,000107
0,000053
S2
0,199
Obliczenia Obliczanie średniej wartości absorbancji: Obliczanie średniej absorbancji przy 412nm: = 0,194-0,0035=0,1905
Obliczanie stężenia molowego anionu nitromerkaptobenzoesowego: ↔ M
Gdzie: A -absorbancja
C - stężenie substancji rozpraszającej w roztworze
E - współczynnik ekstynkcji substancji rozpraszającej (13600 M-1∙cm-1)
l - droga optyczna (1 cm)
Obliczanie wyjściowego stężenia wolnych grup tiolowych ↔ = 5,4044E-7 M
Gdzie: Obliczanie stężenia wolnych grup tiolowych po redukcji Obliczenia wykonane analogicznie do powyżej ( Obliczenie stężenia mostków di siarczkowych…
... zobacz całą notatkę