Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodą oznaczania grup sulfhydrylowych w białkach oraz z jedną z technik oznaczania tych grup za pomocą odczynnika Ellmana. Oznaczenie ilości grup sulfhydrylowych aldolazy A wraz z określeniem stopnia ich ekspozycji do rozpuszczalnika roztworu. Określenie ilości grup SH tzw. „dostępnych” i „niedostępnych” dla odczynnika Ellmana. Oznaczenie „wszystkich” grup SH po uprzednim rozfałdowaniu białka czynnikiem denaturującym.
Wstęp teoretyczny
Cysteina jest aminokwasem występującym powszechnie w cząsteczkach białkowych. W aminokwasie tym występują reszty cysteinylowe związane w mostki di siarczkowe. Reszty te nadają cząsteczce białka szczególne właściwości wynikające z ich specyficznych cech fizyko-chemicznych. Aby móc wyznaczyć wolną ilość reszt cysteinylowych należy cząsteczkę białka poddać wstępnej denaturacji chemicznej ( np. przy udziale 6 M roztworu chlorowodorku guanidyny lub 8 M roztworu mocznika) a następnie przeprowadzić reakcję z udziałem odczynnika Ellmana. Do wyznaczania liczby tioli w cząsteczkach białkowych stosowane są głównie dwie techniki: elektroforetyczna i spektroskopowa. W przypadku tych drugich do obliczeń stosuje się prawo Lamberta-Beera.
Materiały
Odczynniki
Bufor ( 10mM Tris-HCl, 2mM EDTA ) o pH 7.5
4% roztwór siarczanu dodecylu sodu ( SDS ) w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5
10mM roztwór soli potasowej kwasu 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoesowego (DTNB) w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5
Roztwór aldolazy A w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5
Szkoło i aparatura
Probówki chemiczne
Parafilm
Pipety automatyczne oraz tipsy
Kuwety
Spektrofotometr
Przebieg ćwiczenia Spektrofotometryczne oznaczenie białka
Do probówki dodaliśmy 2ml buforu (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5 a następnie wyzerowaliśmy spektrofotometr przy długości fali 280 nm wobec buforu w probówce użytego jako odnośnik
Po opróżnieniu i osuszeniu kuwety wlaliśmy do niej 2ml otrzymanego ( wyjściowego roztworu białka aldolazy A
Zmierzyliśmy absorbancję przy długości fali 280nm
W probówce rozcieńczyliśmy wyjściowy roztwór białka za pomocą buforu (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5 do sumarycznej objętości 4.5 ml bufor: 4,5-2,04=2,46
My do pomiaru wzięliśmy 2ml roztworu wyjściowego białka i 2,5ml buforu
R= Wyzerowaliśmy spektrofotometr i napełniliśmy kuwetę 2ml rozcieńczonego roztworu białka i zmierzyliśmy absorbancję przy długości fali 280nm
Oznaczanie „wszystkich” grup SH w białku
(…)
…]
Obliczenie stężenia molowego aldolazy w mieszaninie reakcyjnej * = * = = =1,16*10-6 [M]
Obliczenie molowego stężenia anionu nitromerkaptobenzoesowego w badanych roztworach.
ε-molowy współczynnik ekstynkcji przy długości fali 412nm = 13600[1/(mol*cm)
CTNB-= = =3,61*10-5 [M]
CTNB-= =3,61*10-5 [M] („wszystkie” grupy tiolowe w białku) Obliczenie stosunku molowego „wszystkich” grup tiolowych w białku do aldolazy…
… Lamberta-Beera.
Materiały
Odczynniki
Bufor ( 10mM Tris-HCl, 2mM EDTA ) o pH 7.5
4% roztwór siarczanu dodecylu sodu ( SDS ) w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5
10mM roztwór soli potasowej kwasu 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoesowego (DTNB) w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5
Roztwór aldolazy A w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5
Szkoło i aparatura
Probówki chemiczne
Parafilm
Pipety…
… roztworu białka i 1ml wyjściowego roztworu (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA o pH 7.5 + 4%SDS ) Po wymieszaniu do wszystkich probówek dodaliśmy sól potasową kwasu 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoesowego (DTNB) w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5 w objętości 0,1ml dzięki czemu otrzymaliśmy 20-krotne rozcieńczenie 2ml+x=20x 2ml=19x x=0,1ml
Pozostawiliśmy probówki w temperaturze pokojowej na 15min
Zmierzyliśmy…
…, ponieważ tylko w taki sposób mogliśmy wyeksponować wszystkie grupy, nawet te, które w normalnych warunkach są niedostępne. Czynnik denaturujący tak reaguje z cząsteczką białka, że rozcina jedynie mostki disiarczkowe nie modyfikując przy tym innych grup funkcyjnych występujących w białku.
…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)