To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Oznaczanie ekspresji genów reporterowych
1. Zasada badania aktywności transkrypcyjnej sekwencji genomowych techniką genów reporterowych.
Gen reporterowy- gen wizualizujący.
Gen reporterowy jest łączony z sekwencją, która ma być badana, np. potencjalne miejsca promotorowe, otwarte ramki odczytu. Koduje białko, które może być wykryte bezpośrednio (emisja światła), lub jego aktywność jest rozpoznawana w wyniku reakcji enzymatycznej prowadzącej do powstania łatwo wykrywalnego produktu (np. zmiana koloru). W wyniku wzrostu aktywności badanej sekwencji następuje ekspresja genu reporterowego kodującego odpowiednie białko, a aktywność białka mierzy się za pomocą technik: autoradiograficznych, spektrofotometrycznych, chemi- i bioluminescencyjnych. Wyższa aktywność- większa produkcja białka, a w związku z tym silniejszy sygnał. Jeśli nie doszło do transfekcji komórek, nie otrzymujemy żadnego sygnału (brak aktywności genu reporterowego).
Cechy dobrego genu reporterowego:
1. nie występuje naturalnie u organizmu-biorcy, pojawia się u niego dopiero w następstwie udanej transformacji
2. dostarcza produktu dającego łatwo dostrzegalną fenotypową zmianę, np. powoduje syntezę jakiegoś barwnika albo świecenie
3. nie powoduje żadnych zakłóceń fizjologicznych w organizmie- biorcy
4. jego produkt jest stosunkowo nietrwały
5. kodowane przez ten gen białko zachowuje swoją aktywność nawet po przyłączeniu do jego końca (N lub C) innego peptydu
2. Klasyfikacja stsowanych praktycznie genów reporterowych- pochodzenie, sposoby oznaczania, wady i zalety.
3. Szczegółowe omówienie własności genów i białek reporterowych zastosowanych w ćwiczeniu: SEAP, lucyferazy, białek fluoryzujących.
I Wydzielnicza fosfataza alkaliczna SEAP (na wektorze pCMV)-
SEAP- zmutowana forma ludzkiego łożyskowego AP, nie posiadająca 24 aminokwasów na C-terminalnym końcu białka. Usunięcie tych aminokwasów zapobiega zakotwiczeniu się enzymu w błonie plazmatycznej i jest on wydzielany z komórki (jak dojdzie do ekspresji, białko jest wyrzucane na zewnątrz komórki i można oznaczyć SEAP w medium).
SEAP jest łatwo wykrywany po hydrolizie bezbarwnego substratu fosforanu p-nitrofenolu (PNPP). Fosfataza alkaliczna powoduje przekształcanie substratu do p-nitrofenolu, który daje żółte zabarwienie, którego intensywność jest tym większa, im więcej jest fosfatazy (rośnie absorbancja).
Enzym jest stabilny w stosunku do ogrzewania i inhibitora fosfatazy I-homoargininy (w celu inaktywacji drugoplanowych AP można użyć wysokiej temp lub inhibitora fosfatazy, co eliminuje wysokie tło związane z działalnością systemu reporterowego AP)
(…)
… światła jest tym większe, im wyższe jest stężenie ATP (wprost proporcjonalne do ilości ATP). Produkowane światło jest widoczne w kilkanaście sekund po dodaniu do probówki zawierającej ATP lucyferyny i enzymu lucyferazy i daje się oznaczyć za pomocą czułego detektora- luminometru.
Procedura:
1) Pobranie próbki, jeśli są one w formie płynnej to trzeba zawiesić ją w r-rze buforującym.
2) Ekstrakcja ATP…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)