To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Kaja Fac
Środa, 19.10.2011r.
Sprawozdanie z ćw. 3
Otrzymywanie i badanie hydrolizatu RNA z drożdży
Otrzymanie hydrolizatu kwasu rybonukleinowego z drożdży
Na wadze technicznej zważyłam 20,57 g drożdży piekarskich, a następnie przeniosłam je do zlewki, do której dodałam 24 cm3 wody destylowanej. Całość rozmieszałam na jednolitą masę. Mieszając bagietką dolałam 5 cm3 40 % NaOH. Po 10 minutach dodałam 4 cm3 stężonego HCl, a następnie około 1,25 ml lodowatego kwasu octowego ( do pH~4 względem uniwersalnego papierka wskaźnikowego). Po odczekaniu kolejnych 10 minut, wytrącił się osad białek, który odsączyłam na lejku Schotta. Przesącz był klarowny, barwy lekko żółtej.
Do cylindra miarowego przelałam 10 ml przesączu. Następnie przelałam go do małej zlewki, do której dodałam 2 ml 6% roztworu MgSO4. Osad niestety się nie wytrącił, więc dodałam niewielką ilość 10 % roztworu HCl, po którym nastąpiło wytrącenie osadu. Następnie podzieliłam roztwór z wytrąconym osadem pomiędzy dwie probówki (w między czasie sprawdzałam wagę probówek, aby była mniej więcej taka sama) i odwirowałam osad ( 10 min, 3-4 tys rpm). Odrzuciłam supernatant, a osad nukleinianu magnezu przeniosłam do dwóch probówek eppendorfa, po czym do każdej dodałam etanolu. Osad lekko rozdrobniłam na wytrząsarce, w celu dokładnego zawieszenia osadu w etanolu. Ponownie odwirowałam osad. W kolejności przemyłam osad dwukrotnie etanolem i na koniec eterem - w każdym wypadku postępowałam w tej samej kolejności: wytrząsanie osadu na wytrząsarce w celu dokładnego przemycia, a następnie odwirowanie. Po przemyciu eterem osad wysuszyłam w piecu. Tak otrzymany osad był podstawą do sporządzenia 0,1 % i 0,2 % roztworu RNA.
Przygotowanie 0,1% roztworu RNA.
Osadu z jednej z dwóch probówek eppendorfa rozpuściłam w 10 ml 0,1M roztworu NaOH. Osad całowicie się rozpuścił (roztwór był klarowny). Przygotowanie 0,2% roztworu RNA i hydroliza kwasowa tego roztworu.
Osad z drugiej probówki eppendorfa (mniejszą ilość) przeniosłam do probówki typu falcon 15 ml i rozpuściłam w 2 ml 0,1M roztworu NaOH. Następnie do falconu dodałam 2 ml 1M roztwrou H2SO4 (nastąpiło zmętnienie roztworu). Tak przygotowaną próbkę włożyłam do wrzącej łaźni wodnej na 45 minut. Po określonym czasie wyjęłam falcon z łaźni wodnej i zauważyłam brak zmętnienia. W kolejności do 4 szklanych probówek dodałam odpowiednio:
1 ml 0,1% RNA
1 ml 0,1% hydrolizatu RNA (przygotowanego wcześniej)
1 ml wzorcowego fosforanu
1 ml wody destylowanej
+ 2 ml roztworu molibdenianu amonu
+ 1 ml metolu
(…)
… wzorcowego fosforanu
1 ml wody destylowanej
+ 2 ml roztworu molibdenianu amonu
+ 1 ml metolu
Zasada: Kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecności HNO3, w wyniku czego powstaje nierozpuszczalny żółto zabarwiony osad fosfomolibdenianu amonu.
H3PO4+12 (NH4)2MoO4+23 HNO3 -> (NH4)3[P(Mo3O10)4]*2 H2O + 21 NH4NO3 + 2HNO3 + 10 H2O
obserwacje
Najmniej intensywny kanarkowo-żółty osad i klarowny żółty…
… do tej samej probówki)
brak zmian
brak zmian
EtOH ok. 2 ml
do kolejnych dwóch probówek
nastąpiło zmętnienie
nastąpiło zmętnienie
wnioski
Reakcja orcynolowa.
1 ml 0,1% RNA
1 ml wzorcowego DNA
1 ml 0,1% roztworu rybozy
1 ml 0,1% roztworu galaktozy
1 ml wody destylowanej
+ 1 ml odczynnika orcynolowego ( ogrzewanie we wrzącej łaźni wodnej przez 5-6 minut). Każdy roztwór miał kolor żółty po dodaniu odczynnika.
Zasada: W obecności FeCl3, furfural powstający z rybozy w środowisku HCl daje z orcyną kompleks o barwie zielonej.
obserwacje
zmiana barwy na ciemnozieloną
zmiana barwy na jasnozieloną
zmiana barwy na ciemnozieloną
zmiana barwy na jasnozieloną
brak zmian, roztwór pozostał żółty
wnioski
Reakcja z floroglucyną.
1 ml 0,1% RNA
1 ml wzorcowego DNA
1 ml 0,1% roztworu rybozy
1 ml 0,1% roztworu galaktozy
1 ml wody destylowanej
+ 1 ml stężonego HCl i parę kryształków floroglucyny. Ogrzewanie do wrzenia w łaźni wodnej. Zasada: Pentozy w obecności floroglucyny barwią roztwór na czerwono. obserwacje
zmiana barwy na czerwono-brązowy
zmiana barwy na brudnozieloną
zmiana barwy na bardzo ciemny brąz
zmiana barwy na czerwonobrązowy
brak zmian
wnioski
Reakcja Dischego.
1 ml 0,1% RNA
1 ml wzorcowego DNA
1 ml 0,1…
….
obserwacje
brak zmiany barwy
roztwór zmienił kolor na granatowy
brak zmiany barwy
roztwór zabarwił się na granatowo
brak zmiany barwy
wnioski
Spektrofotometryczne oznaczanie czystości preparatu RNA. Z 0,1% roztworu RNA odpipetowałam 100 μl pipetą automatyczną i przeniosłam do probówki typu falcon o pojemności 15 ml i dopełniłam do 5 ml wodą destylowaną. Następnie napełniłam szklaną kuwetę i zarejestrowałam…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)