To tylko jedna z 4 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Paulina Krzemińska 19.10.2011 r.
Opis doświadczenia 3: Otrzymywanie i badanie hydrolizatu RNA z drożdży.
Izolacja hydrolizatu RNA z drożdży:
Zmieszałam 20,57 g drożdży z 24 ml wody destylowanej w celu rozpuszczenia ich i przeprowadzenia do roztworu wodnego.
Do roztworu dodałam 5 ml 40%-owego roztworu NaOH w celu przeprowadzenia hydrolizy kwasu nukleinowego, roztwór pozostawiłam na 7 minut.
Do roztworu dodałam 4 ml stężonego roztworu HCl, a następnie ok. 1,5 ml lodowatego kwasu octowego tak, aby pH roztworu miało wartość pomiędzy 4, a 5. Po około 8 minutach odsączyłam powstały osad białek na lejku Schotta i otrzymałam klarowny, jasnożółty roztwór kwasu nukleinowego.
Pobrałam 10 ml przesączu i dodałam do niego 2 ml 6%-owego roztworu MgSO4, a następnie niewielką ilość HCl, aby wytrącił się osad soli magnezu z kwasem nukleinowym.
Osad odwirowałam, a następnie odrzuciłam klarowny roztwór i przeniosłam osad do dwóch probówek eppendorfa.
Przemyłam i wytrząsałam osad 3 razy etanolem i raz eterem (niżej wrzący, łatwiej odparował z osadu).
Otrzymałam hydrolizat RNA niezbędny do dalszych badań.
Przeprowadzone doświadczenia:
Przed przystąpieniem do analizy jakościowej otrzymanego hydrolizatu, przygotowałam 0,1-molowy roztwór RNA poprzez rozpuszczenie zawartości eppendorfa, w którym było więcej hydrolizatu, w 10 ml H2O. Osad całkowicie się rozpuścił i tego roztworu używałam do przeprowadzenia następujących reakcji:
Badanie rozpuszczalności:
Dodany odczynnik
RNA
DNA
HCl/obserwacje
Brak zmian
Brak zmian
NaOH/obserwacje
Brak zmian
Brak zmian
Wnioski
Na podstawie tego doświadczenia można napisać, iż DNA i RNA rozpuszczają się w kwasie i w zasadzie. Nie jest to prawda, ponieważ kwasy nukleinowe rozpuszczają się tylko w zasadach. Zafałszowanie wyników doświadczenia mogło być spowodowane za małym dodatkiem kwasu lub nieczystością odczynników z których korzystałam.
Et-OH/obserwacje
Zmętnienie
Zmętnienie
Wnioski
Kwasy nukleinowe nie rozpuszczają się w alkoholach. Jest to spowodowane zmianą polarności, jaką niesie ze sobą dodatek alkoholu, przez co zaburza strukturę kwasów.
Reakcja orcynolowa:
Dodany odczynnik
RNA
DNA
ryboza
galaktoza
H2O
Odczynnik orcynolowy + ogrzewanie/ obserwacje
Ciemnozielony roztwór
Jasnozielony roztwór
Ciemnozielony roztwór
Jasnozielony roztwór
(…)
… niesie ze sobą dodatek alkoholu, przez co zaburza strukturę kwasów.
Reakcja orcynolowa:
Dodany odczynnik
RNA
DNA
ryboza
galaktoza
H2O
Odczynnik orcynolowy + ogrzewanie/ obserwacje
Ciemnozielony roztwór
Jasnozielony roztwór
Ciemnozielony roztwór
Jasnozielony roztwór
Brak zmian / żółty roztwór
Wnioski Reakcja orcynolowa ma na celu wykrycie cukru - pentozy. Według literatury deoksyryboza z oryną i FeCl3 daje dziesięciokrotnie słabszy kompleks podczas tej reakcji, niż ryboza, natomiast galaktoza jest heksozą. Na podstawie tych informacji można wnioskować, iż przeprowadzone przeze mnie doświadczenie przebiegło w pożądany sposób.
Reakcja z floroglucyną:
Dodany odczynnik
RNA
DNA
ryboza
galaktoza
H2O
HCl + floroglucyna + ogrzewanie/ obserwacje
Czerwono - brązowy roztwór
Brudnozielony roztwór
Bardzo ciemno - brązowy roztwór
Czerwono - brązowy roztwór
Brak zmian
Wnioski
Ta reakcja mana celu wykrycie również pentozy, ponieważ wiadomo, iż w obecności floroglucyny te cukry barwią roztwór na czerwono. Przeprowadzone przeze mnie doświadczenia niestety nie potwierdziły obecności pentozy w DNA (a powinno), oraz co dziwne, wynik galaktozy wyszedł w sposób, jakby była ona właśnie pięciowęglowym cukrem…
… RNA odpipetowałam 0,1ml i przeniosłam do 15-mililitrowego falconu, po czym dopełniłam do 5 ml. Po dokładnym rozmieszaniu roztworu napełniłam nim szklaną kuwetę i przeprowadziłam pomiar spektrofotometryczny w zakresie długości fal od 230 do 300 nm.
Pomiar jest prowadzony w takim zakresie długości fal, ponieważ zasady azotowe pochodzące od puryny i pirymidyny mają maksimum absorpcji właśnie około 260…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)