Biochemia – sprawozdanie 4 Oczyszczanie białek metodą sączenia molekularnego Opis doświadczenia Przez kolumnę chromatograficzną, napełnioną roztworem NaCl, przepuszczamy zawiesinę żelu Sephadex G75, następnie otwieramy wylot i przepłukujemy roztworem NaCl i po wyrównaniu poziomu cieczy z górną powierzchnią słupa żelu zamykamy wylot Pipetą nanosimy na powierzchnię złoża żelu 300 µl mieszaninę Blue Dextranu heksocyjanażelazianu (III) potasu i albuminy z osocza bydlęcego (BSA) Otwieramy wylot kolumny i zbieramy do ponumerowanych probówek wyciek z kolumny (po 1 ml) W momencie wsiąknięcia barwnego roztworu w żel, przy pomocy pipety Pasteura dolewamy 0.9% roztwór NaCl i prowadzimy dalej chromatografię, uzupełniając poziom roztworu nad żelem, aż do całkowitego wymycia roztworu heksacyjanożelazianu (III) potasowego Przerywamy elucję, wylewamy żel do zlewki i mierzymy objętość jaką zajmował żel, napełniając kolumnę wodą i mierząc objętość wody. Notujemy jako wartość Vtot. Do wszystkich zebranych frakcji dodajemy po 2 ml eluentu i mierzymy absorbancję przy długości fali 620 nm (Blue Dextran) i 280 nm (albumina). Notujemy wyniki. Na papierze milimetrowym robimy diagram elucji. Obliczamy dla BSA wartość współczynnika podziału pomiędzy fazą ciekłą a żelową KAV Obserwacje Numer frakcji Absorbancja 280 nm 620 nm 1 0 0 2 0,013 0,010 3 0,016 0,010 4 0,014 0,010 5 0,014 0,010 6 0,019 0,011 7 0,016 0,011 8 0,014 0,009 9 0,016 0,010 10 0,096 0,031 11 0,127 0,036 12 0,039 0,015 13 0,027 0,010 14 0,092 0,010 15 0,344 0,009 16 0,408 0,050 17 1,555 0,000 18 0,622 0,000 19 0,996 0,000 20 0,533 0,000 Obserwacje Uzyskano 14 probówek zawierających po 1 cm3. Barwę niebieską reprezentował roztwór zawierający Blue Dextran, natomiast zielonkawo-żółtą roztwór z heksocyjanażelazianu (III) potasu. Obliczenia KAV = Ve – V0/ Vtot – V0 Ve – objętość elucyjna BSA V0 – objętość pusta kolumny (objętość elucyjna Blue Dextranu) Vtot – objętość całkowita złoża Ve = 17 cm3 V0 = 16 cm3 Vtot = 17 cm3 KAV = 17-16/17-17 = 0 Wnioski Wykres ukazuje, że zależność absorbancji od objętości dla fali długości 280 nm wyniosła 17 cm3, a dla długości 620 nm 16 cm3. Wynik KAV równy 0 wskazuje na to, że rozdział mieszanin nie nastąpił. Udało się oddzielić jedynie heksacyjanożelazianu(III) potas, ponieważ jego cząsteczki zatrzymywały się w
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)