To tylko jedna z 4 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Cel ćwiczenia
Rozdział białek na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-75.
Wyznaczenie dostępnych współczynników podziału Kav dla badanych białek.
Wykreślenie profilu elucji dla przeprowadzonego procesu chromatografii żelowej.
Przygotowanie próbek do elektroforezy żelowej. Wstęp teoretyczny
Chromatografia żelowa jest jedną z form cieczowej chromatografii, w której substancje są rozdzielane w zależności od wielkości ich cząsteczek. Żel zbudowany jest z porowatych granulek. Do wnętrza każdej granulki może swobodnie wchodzić rozpuszczalnik. Podczas przechodzenia cząsteczek substancji rozpuszczonych przez kolumnę mniejsze cząsteczki dyfundują do wnętrza porowatych granulek żelu, a duże cząsteczki w ogóle nie wnikają do wnętrza granulek i spływają z frontem rozpuszczalnika w dół kolumny. W efekcie małe cząstki będą zatrzymywane na kolumnie w stopniu zależnym od ich zdolności dyfuzji do wnętrza żelu. Zbierane frakcje badane są w celu stwierdzenia kolejności wymywania poszczególnych składników z kolumny. Wielkością charakteryzującą cząsteczkę w chromatografii żelowej jest objętość elucji. Jest to objętość rozpuszczalnika niezbędna do przeniesienia danej substancji przez kolumnę wypełnioną żelem aż do pojawienia się jej maksymalnego stężenia w eluacie opuszczającym kolumnę. Materiały
Odczynniki
bufor (20 mM TRIS-HCl, 0.1 M NaCl) o pH 7.5 - eluent
próbka - roztwór Blue Dextranu (stężenie końcowe w próbce - 2 mg/ml), roztwór mieszaniny białek owoalbuminy i lizozymu (5 mg/ml)
złoże Sephadex G-75 zawieszone w buforze ( 20 mM TRIS-HCl, 0.1 M NaCl) o pH 7.5
2x stężony bufor do nanoszenia próbek na PAGE (124 mM Tris-HCl, 4% SDS (w/v), 10% (v/v) β-merkaptoetanol, 20% (v/v) glicerol, 0.005 (w/v) błękit bromofenolowy, pH 6.8)
Szkło i aparatura
kolumna chromatograficzna
probówki pomiarowe do spektrofotometru Specol
2 cylindry miarowe o pojemności 5 ml
Cylinder miarowy o pojemności 10 ml
Zlewki i kolby o pojemności 250 i 500 ml
Bagietka
Tryskawka
Pipety automatyczne oraz końcówki
Specol
Spektrofotometr UV
Przebieg ćwiczenia
Wyznaczanie objętości zerowej kolumny
Przygotowaliśmy próbówki szklane, do których zbieraliśmy frakcje z kolumny.
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)