Fragment notatki:
Chciałem jeszcze taka metodę pan stu pokazać czy przedstawić – metodę quick change, czyli szybka
zmiana. Można pewnie o niej znaleźć informacje w Internecie jeszcze .
Przyczyną na tej metody jest dążenie do bardzo efektywnej wymiany i otrzymania produktu, który ze
100% pewnością powinien zawierać mutacje (czyli podobnie jak dla metody meta driver to o samo by
było). Bazujemy na bardzo prostej obserwacji, zgodnie z którą DNA, który jest replikowany w
komórce bakteryjnej, podlega metylacji. Bardzo często zapominamy, ze cząsteczki DNA plazmidu,
który otrzymujemy z komórek są właśnie zmodyfikowane. Systemy metylacyjne w komórkach
bakteryjnych szczepu k12, którego używamy do klonowania są różne. Są tez różne szczepy
pochodnych k12, które mają zmienione wzorce metyzacji, ale należy się spodziewać, ze DNA będzie
etylowane. Jest tez bardzo ważnym, żeby pamiętać, że wiele enzymów restrykcyjnych jest
wrażliwych na metylację różnego typu, także w danych konkretnego enzymu restrykcyjnego bardzo
często otrzymujemy informację o podatności na metyzację. Trzeba to często brać pod uwagę i
konfrontować ze sobą informację o szczepie i o wrażliwości enzymu.
Ale teraz zostawmy to na boku i pamiętajmy, że DNA jest zmieniony przez metylację. Fakt metyzacji
cząsteczki plazmidu jest pokazany przez grupy Ch3. Oczywiście zakres metylacji jest większy niż to,
co widzimy na schemacie. W technice quick change bazujemy na tym fakcie, ze cząsteczka DNA jest
zmodyfikowana przez metylację. DNA jest izolowany, następnie poddawany denaturacji. Denaturacja
jest po to, żeby otrzymać pojedynczą nic. I następnie DNA jest hybrydyzowany (po denaturacji) z
oligonukleotydem, który wprowadza mutacje. To mogą być tez małe oligonukleotydy, z których
jeden komplementarny jest do jednej nici po denaturacji, a drugi do drugiej. Jak wiecie państwo na
pewno albo domyślacie się, że oligonukleotydów jest w dostatecznie w dużym stężeniu , ażeby po
denaturacji oligonukleotyd był komplementarny do nici, które hybrydyzują. Także nie ma tutaj
preferencji hybrydyzacji jednej i drugiej nici, tylko raczej każda z nich hybrydyzuje z odpowiednim
oligonukleotydem. A wiec już mamy odtworzoną sytuację mutagenezy, kierowanej przez
oligonukleotydy. Następnie nici powinny być odtworzone i to uzyskuje się przez PCR prowadzony
przez polimerazę z aktywnością korekcyjną – np. polimerazę Pfu. Teraz skupmy się przez moment i
zastanówmy jakie mogą być produkty. Mogą być produkty, które zwierają nici metylowane -to będą
pewnie jako pierwotne cząsteczki, jakie włożyliśmy do układu. Większość produktów będzie
pozbawiona metyzacji – to będą te cząsteczki które poprzez PCR będą syntezowane w przerażającej
większości. W sensie eksperymentu metylacyjnego nas interesują tylko cząsteczki bez metylacji,
zatem należy pozbyć się produktów metylowanych. Pozbywamy się ich, traktując preparat enzymem
dpnI. DpnI jest enzymem restrykcyjnym, który trawi tylko te sekwencje DNA, które są metylowane.
Zatem metylowane cząsteczki DNA zostaną sfragmentowane, podzielone na krótsze fragmenty,
których jest dużo, bowiem jest dużo miejsc metylacji w plazmidzie. Taki plazmid sfragmentowany nie
będzie transformował efektywnie komórek bakteryjnych, a nawet jakby się tak zdarzyło, to te
fragmenty nie będą replikowały w komórkach. Z wydajnością 99% dostaniemy klony z wprowadzoną
mutacją. Przez oligonukleotydy można wprowadzić wiele mutacji na raz, dokonać delecji, insercji. Na
tym polega metoda, w której wykorzystujemy fakt, iż DNA jest piętnowany w komórce bakteryjnej
przez metylację.
Kolejna metoda wykorzystująca PCR do generowania mutantów opiera się na 2reakcjach. Nie jest to
jednak metoda mega primera (bowiem ta wykorzystująca megaprimer jest użyteczna tylko jeżeli
miejsca restrykcyjne nie są zbyt odległe. Jeżeli są natomiast bardzo odlegle, pojawiają się problemy
związane z bardzo dużym megaprimerem).
Korzysta się z metod alternatywnych. Jedna z nich, przedstawiona na schemacie jest bardzo prosta.
Otóż widzimy sekwencję, do której musi być wprowadzona mutacja. W pierwszym etapie dzielimy
sekwencję na 2fragmenty, mamy 2 startery i wykonuje się 2reakcje PCR. W jednej nici wprowadzana
jest mutacja po prawej stronie fragmentu lewego czyli na 3’koncu i po lewej stronie fragmentu
prawego czyli na 5’koncu też jest mutacja. Oba produkty ze sobą hybrydyzujemy. Produkt ma 2
wolne końce 3’, więc po zastosowaniu polimerazy i reakcji PCR otrzymujemy produkt PCR.
Niestandardowe metody mutagenezy:
Synteza sztucznego genu
Konieczna, kiedy potrzeba otrzymania optymalnej sekwencji do ekspresji.
Istnieje coś takiego jak preferencja hodowli: chodzi o to, że nie wszystkie kodony kodu
genetycznego są równie często reprezentowane w organizmie. Załóżmy, że chcemy przeprowadzać
syntezę białka eukariotycznego w kom E.coli prokariotycznej. Niektóre z kodonów, które są używane
w komórkach eukariotycznych, nie są używane w prokariotycznych, albo są bardzo rzadko.
Wyobraźmy sobie, ze mamy gen eukariotyczny, w którym te rzadkie hodowle są nadreprezentowane.
Gdyby taki gen w postaci cDNA włożyć do komórki prokariotycznej, synteza białka rekombinowanego
mogłaby w ogóle nie mieć miejsca, właśnie ze względu na kodony niepreferowane w e.coli.
W takiej metodzie otrzymujemy sekwencję optymalną. Wybieramy te geny które są optymalne dla
e.coli, oczywiście nie zmieniając sekwencji białka. Możemy wprowadzać mutacje, jeśli będą one
korzystne. I to jest właśnie najczęstszy powód syntezy genu sztucznego.
Synteza to jest nic innego jak otrzymanie szeregu oligonukleotydow, czyli krótkich fragmentów, które
złożone w całość dadzą nam sekwencje sztucznego genu.
Otrzymuje się szereg nukleotydów o zachodzących na siebie sekwencjach, które są zmieszane ze
sobą i przeprowadza się syntezę brakujących fragmentów przez polimerazę DNA. Polimeraza DNA
wypełnia luki. Następnie używamy ligazy i otrzymujemy geny sztuczne. Metoda sprawdza się dla
krótkich sekwencji, ale jest nieekonomiczna dla sekwencji reprezentujących cały sztuczny gen.
Dlatego otrzymuje się krótkie oligonukleotydy i je stapia, hybrydyzuje ze sobą, żeby otrzymać
sekwencję sztucznego genu.
Wróćmy do Bibliotek: możliwe jest otrzymanie całej kolekcji genów, jeśli użyjemy jakiejś biblioteki
oligonukleotydów dla wybranej sekwencji.
Kolejna lustracja dotyczy metody używanej do otrzymywania genów które nie występują w
przyrodzie, i które hodują białka również niewystępujące w przyrodzie:
Mieszanie – DNA shuffling. Wykorzystuje się ją bardzo często w inżynierii białka do otrzymania białek
o jakichś nadzwyczajnych właściwościach np: bardzo aktywnych proteaz, lipaz. Firmy
biotechnologiczne, które dostarczają enzymów o znaczeniu przemysłowym korzystają właśnie z tej
metody (np. do produkcji proszku stosuje się enzymy o ulepszonych właściwościach).
DNA shuffling polega na tym, że dokonuje się przypadkowej wymiany fragmentów genu. Geny muszą
być pokrewne ewolucyjnie. Na schemacie widzimy pragen, który w wyniku ewolucji dał 4 różne
wyspecjalizowane wersje - każda z wersji genu koduje inny produkt o funkcji wyspecjalizowanej w
toku ewolucji dla danego organizmu. Wyobraźmy sobie, że jest to produkt, który by nas interesował,
ale właściwości opisane dla każdego: 1,2,3,4 nam nie odpowiadają. Załóżmy, że chcemy mieć
produkt o aktywności w obniżonej temperaturze, albo termostabilny. Moglibyśmy teraz co zrobić?
Moglibyśmy przez mutagenezę przypadkową centrum katalitycznego tego pierwszego genu,
moglibyśmy zmieniać go i badać produkty, moglibyśmy drugi tak samo, 3,4. Ale inżynieria białka
pokazuje, że czego należy się spodziewać? Że jeżeli mamy jakieś tam białko, sfałdowane (teraz
wyobraźmy sobie że tu jest centrum katalityczne) i takim logicznym podejściu zajmujemy się
aminokwasami tymi które to centrum tworzą – tu zaczynamy kombinować i coś zmieniać
wykorzystując metody mutagenezy ukierunkowanej z wykorzystaniem bibliotek nukleotydów.
DNA shuffling odnosi się od obserwacji eksperymentalnej, które pokazują, że białko o lepszych
właściwościach powstanie, jeśli dokona się wymiany reszt poza centrum katalitycznym. Jest to
zaskakujące, ale struktura 3rzędowa powstaje przez oddziaływanie wielu reszt i każde z tych oddział
ma wpływ na właściwości cząsteczki białka i aktywność centrum katalitycznego. W DNA shuffling
uznajemy ten fakt i zmierzamy do otrzymania cząsteczki białka bardzo podobnej do wyjściowej, ale
jednocześnie różnej (nie tylko w centrum katalitycznym, ale w innych fragmentach też.).
W DNA shuffling bierzemy te wszystkie sekwencje, każdą z osobna, izolujemy (z jakiejś biblioteki lub
innego źródła też możemy ją wyprowadzić) i dzielimy na fragmenty, przypadkowe. Te przypadkowe
sekwencje są łączone ze sobą, mieszane, „szuflowane”. Dają one geny hybrydowe, które kodują
enzymy i białka pochodzące z różnych genów.
Czy To ma sens? Taki eksperyment daje często białko o lepszych właściwościach pożądanych przez
eksperymentatorów. Wynik jest jednak trudny do przewidzenia. Tak jak w każdej metodzie, w której
posługujemy się biblioteką zdegenerowanych nukleotydów, potrzebny jest skrypt - potrzebna jest
met oda, która pozwala na znalezienie odpowiedniego produktu białkowego.
Wyobraźmy sobie, że poszukiwaliśmy mutanta odpornego na działanie wysokiej temperatury. Test
byłby bardzo prosty. Biblioteką genów już wektora transformujemy komórki bakteryjne, wysiewany
na podłoże, podnosimy temperaturę do optymalnej dla naszych celów np. 40st , w podłożu znajduje
się substrat dla naszego enzymu, którego produkt jest dany. I byśmy szukali tych klonów, tych
kolonii, w których pojawiłoby się zabarwione podłoże w wysokiej temperaturze. Także nie
musielibyśmy izolować białka z każdego klonu, tylko wszystkie klony byłyby analizowane
jednocześnie przez obserwację makroskopową. Poprzez ocenę zabarwienia podłoża znaleźlibyśmy
klony najbardziej aktywne. Te klony mogłyby być dalej optymalizowane np. poprzez mutagenezę
ukierunkowaną, czy mutagenezę, która dotyczy wybranych fragmentów, które są w jakiś sposobów
ważne lub interesujące. I to jest technika DNA shuffling.
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)