To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Mutageneza z otrzymanie całego szeregu mutantów:
1. Mamy gen którego fragment odpowiada sekwencji kodującej reszty istotne dla aktywności
enzymu oraz miejsca restrykcyjne R1 i R2 otaczające te sekwencję czyli kasetę.
2. Zamiast wprowadzać różne mutację i badać ich efekt a także efekt kilku mutacji jednocześnie
(może zachodzić synergizm) wykonujemy bibliotekę oligonukleotydów odpowiadające tej
kasecie. Biblioteka zawiera dla każdej pozycji i kombinacji pozycji, różne sekwencję
3. Bibliotekę poddaje się ligacji z wektorem.
4. Otrzymujemy bibliotekę fagów – tysiące mutantów
5. Biblioteką fagów poddajemy transformacji komórki bakteryjne.
6. Otrzymujemy bibliotekę w postaci kolekcji klonów które są dalej analizowane pod kontem
aktywności
W ten sposób postępując otrzymuje się nowe białka o nowych ulepszonych właściwościach.
Mutageneza sterowana oligonukleotydowo:
Sekwencja normalna – typu dzikiego
Oligonukleotyd wprowadza mutację – w tym wypadku punktową. Jest w części
komplementarny do sekwencji typu dzikiego, po za miejscem które wprowadza mutację. W
ten sposób można też wprowadzać delecję czy insercję
Mutacja jest racjonalnie wprowadzona do sekwencji oligonukleotydu
Sekwencja typu dzikiego w tym wypadku to sekwencja w kolistym wektorze M13(pojedyncza
nić) ale może być to inny kulisty genom.
ssDNA hybrydyzuje z nukleotydem
Przy użyciu polimerazy DNA i dNTP-ów otrzymujemy cząsteczkę typu dsDNA
Tym wektorem transformujemy komórki bakteryjne
W bakteriach zachodzi replikacja DNA i podział komórek. Replikacja dotyczy obu nici!
Otrzymujemy 2 typy komórek – jedne z DNA typu dzikiego a drugie ze zmutowanym
DNA(obie nici) w zależności od nici macierzystej która została użyta do syntezy DNA tej
komórki
Bakterie identyfikuje się po wysianiu na podłoże stałe w odpowiedniej gęstości tak by
możliwe było rozróżnienie klonów.
Problemy pojawiają się w komórce na poziomie replikacji (?) ale sama metoda jest łatwa
Poszczególne metody mutagenezy różnią się wydajnością gdyż metody te mają różne cele i problemy
do rozwiązania
Mutageneza przy pomocy PCR (mutageneza z wykorzystaniem megaprimera)
Istotą techniki megaprimera(mega startera) jest to że wykonujemy 2 reakcje PCR
Technika ta jest bardzo wydajna dla wprowadzania mutacji punktowych – jeśli wszystko jest
dobrze wykonane to mamy praktycznie 100% pewność że mutacja została wprowadzona
W pierwszej reakcji korzystamy z 2 starterów – jeden zawiera mutację(forward – przedni) i ją
wprowadza a drugi nie zawiera mutacji
Otrzymujemy produkt w którym jest mutacja
W drugiej reakcji znowu posługujemy się dwoma starterami: starter przedni nie zawiera
mutacji a drugim starterem jest produkt reakcji pierwszej – jest bardzo długi więc jest
megaprimerem
Po wykonaniu drugiego PCR otrzymujemy produkt który jest identyczna do sekwencji
wyjściowej z tą różnicą że wprowadziliśmy mutację
Metoda nie jest prosta gdyż używamy mega starter
Problemem jest temperatura hybrydyzacji – jeden starter jest krótki a drugi jest
megaprimerem
Otrzymaną sekwencję zmutowaną można podmienić z sekwencją typu dzikiego w
wektorze(którego kopię sekwencji modyfikowano w PCR) ze 100% skutecznością
Kolejną zaletą jest to że potrzebujemy 3 a nie 4 starterów.
(…)
… w tym wypadku to sekwencja w kolistym wektorze M13(pojedyncza
nić) ale może być to inny kulisty genom.
ssDNA hybrydyzuje z nukleotydem
Przy użyciu polimerazy DNA i dNTP-ów otrzymujemy cząsteczkę typu dsDNA
Tym wektorem transformujemy komórki bakteryjne
W bakteriach zachodzi replikacja DNA i podział komórek. Replikacja dotyczy obu nici!
Otrzymujemy 2 typy komórek – jedne z DNA typu dzikiego…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)