To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
TRAWIENIE WEKTORA, ENZYMY RESTRYKCYJNE
1. enzymy restrykcyje (jak działają, czego potrzebują do swojej aktywności, definicja jednostki aktywności, warunki przechowywania i ich konsekwencje, aktywność gwiezdna, jak zatrzymać reakcje trawienia)*
2. metylacja DNA i jej konsekwencje
3. izoschozomery
4. neoschizomery
5. izokaudamery
6. palindrom
7. cechy dobrych wektorów ekspresyjnych (przypomnieć sobie dyskusje na temat zadania 8 z listy 2 z BM)
8.końce lepkie, tępe, kohezyjne, komplementarne, kompatybilne
9. fosfatazy
10. superskręcony DNA
Enzymy restrykcyjne do swojej aktywności wymagają: -kationu dwuwartościowego
-buforu (TrisxCl) dla utrzymania optymalnego pH
-odczynniki tiolowe mogą być użyteczne dla stabilizacji enzymu a także potencjalnych zanieczyszczeń -niektóre er są bardzo wrażliwe na stężenie jonów sodowych lub potasowych (siła jonowa-im wyższa, tym słabsze oddziaływania elektrostatyczne)
Zatrzymywanie reakcji trawienia:
-dodanie EDTA, który chelatuje jony Mg2+
-ekstrakcja (fenol/chloroform) - inaktywacja białek w próbce, DNA zostaje w fazie wodnej, na granicy faz= zdenaturowane białko. nieodwracalne metody inaktywacji enzymu oraz usuwanie -wytrącanie w etanolu wszystkich cz. er
-inaktywacja pod wpływem temperatury-inkubacja w 65C przez 20 min. (żeby nie dopuścić do wzrostu bakterii)-niektóre pozostaję aktywne w 65C ale tracą swoją zdolność do cięcia w wyższej temperaturze, enzymy termofilne, których optimum zawiera się w 50-55C mogą być inaktywowane-80C przez 20 min. Bufor do ER:
- MgCl (Mg 2+ potrzebne do aktywności enzymu) , NaCl/KCl
- TrisxCl - optymalne pH dla funkcjonowania enzymu
- 2-merkaptoetanol (2-ME) lub DTT ditiotreitol - uzyteczne przy stabilizacji niektórych ER lub mogą stabilizować potencjalne zanieczyszczenia
- BSA - używane jako nośnik i stabilizator białka w trawieniu enzymem restrykcyjnym; odmiareczkowuje zanieczyszczenia i imituje “warunki naturalne” - bo białko lubi towarzystwo innych białek, dodatkowo BSA jest białkiem inertnym tzn. jest w układzie, ale nie oddziałuje z nim.
Obniżoną wydajność reakcji powiązaną z zanieczyszczonymi próbkami DNA możemy znieść przez:
-zwiększnie ilości jednostek enzymu dodanego do mieszaniny reakcyjnej
-zwiększenie objętości mieszaniny reakcyjnej w celu rozpuszczenia potencjalnych inhibitorów
-zwiększenie czasu inkubacji
Niektóre próbki DNA (często miniprepy) mogą być zanieczyszczone DNazami, które wymagają jonów Mg2+ do swojej aktywności. Takie próbki przechowuje się w buforze zawierającym EDTA.
(…)
…
Aby rozciąć superkolisty plazmid lub wirusowe DNA potrzeba wiele jednostek ER.
Na działanie enzymów restrykcyjnych ma wpływ:
-zanieczyszczenia DNA (białka, fenole, chloroform, etanol, EDTA, SDS, wysokie stężenie soli). Najczęściej obecne zanieczyszczenia występują na etapie próbek przygotowanych podczas procedury miniprep.
Cechy dobrych wektorów ekspresyjnych:
- autonomiczna replikacja - własne miejsce ori…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)