To tylko jedna z 5 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Mutagenizacja gatunku
2.1 Mutanty- mutagenizacja zarodników promieniowaniem UV:
1) Stosuje się taką dawkę promieniowania, aby osiągnąć ok. 50% przeżywalności
2) Następuje wtedy redukcja żywych jąder w konidium do 1
3) Dokonuje się selekcji:
a) Pozytywna (bezpośrednia):
Na podłożu selekcyjnym będą rosnąc wyłącznie pożądane mutanty.
Np. selekcja mutantów odpornych na antybiotyk na podłożu z antybiotykiem
b) Negatywna:
Mutanty nie rosną na podłożu selekcyjnym.
Selekcja mutantów ade na podłożu bez adeniny, stosujemy wtedy metodę „replica plates”
Aby otrzymać stabilne mutanty:
Należy nowo otrzymane szczepy krzyżować ze szczepem o przeciwnym typie płciowym i wyizolować pożądany fenotyp z homokariotycznych askospor
Umożliwia to pozbywanie się genów kryptycznych (ukrytych, nie dających ekspresji, myślimy, że nie daje aktywności, może ujawnić się po przesianiu)
2.2 Dlaczego Neurospora crassa jest tak ważna w badaniach genetycznych?:
Prototrof - sam syntetyzuje wszystkie potrzebne do życia składniki (wzrost na podłożu minimalnym + glukoza + sole mineralne + biotyna)
Mutanty auksotroficznne tracą zdolność do syntezy jakiegoś związku i mogą rosnąć tylko na pożywce uzupełnionej w ten składnik. Ułatwia to ich wykrywanie
Haploidalny genom - łatwa identyfikacja zmutowanego genu
Rozmnażanie płciowe pozwala na krzyżowanie mutantów i ich analizę genetyczną
2.3 Identyfikacja/wykrywanie mutacji w szlaku metabolicznym Neurospora:
1. Wychodzimy od jakiegoś szczepu 2. Działanie czynnikiem mutagennym na makrokonidia 3. Krzyżowanie ponownie ze szczepem dzikim, ale o przeciwnym typie płciowym 4. Otrzymujemy worki 5. 1 worek pod mikroskop 6. Rozcinanie igłą preparacyjną i pobieranie po 1 zarodnika (askospoty) z worka 7. Pojedyncze zarodniki przesiewamy na pożywkę kompletną 8. Przesiewamy spory na pożywkę minimalną a. Jeżeli spory rosną na pożywce minimalnej to nie interesujące (bo mają nieistotną mutację lub bez mutacji)
b. Jeśli nie rosną, to oznacza że mają mutację, która powoduje zaburzenia w szlaku metabolicznym, np. brak syntezy jakiegoś AA lub zasady nukleotydowe. W tym przypaku wykonujemy kolejne punkty 9. Przesiew na pożywkę minimalną + na pożywkę z jakimś aminokwasem np. alaniną, Jeśli na minimalnej nie rośnie, a na pożywce z dodatkiem alaniny rośnie, to zaburzony szlak syntezy alaniny.
(…)
… wzrost na podłożu minimalnym to wykonujemy posiew na podłoże zawierające wszystkie AA, witaminy, puryny i pirymidyny. Analizując wzrost na danym podłożu zawężamy obszar poszukiwań i uzyskujemy odpowiedź, w szlaku jakiej grupy związków doszło do mutacji (czy w AA , czy w witaminach). Przykłady identyfikacji:
grupa mutantów wymagających do wzrostu argininy
badamy czy mutacja dotyczy jednego, czy kilku genów kodujących enzymy tego szlaku
2.4 Ustalenie typów mutacji u Neurospora crassa w grupie auksotrofów argininowych:
Na podstawie wcześniej opisanych etapów, wiemy że np. mutacja wystąpiła w szlaku związanym z argininą. Chcemy się dowiedzieć, gdzie dokładniej. Wiemy, że szlak wytwarzania Arg wygląda następująco: prekursor ornityna cytrulina arginina
enzym A enzym B enzym C
gen a gen b gen c
Posiewamy i sprawdzamy, na którym będzie rósł nasz szczep
I przypadek: uszkodzony gen a - Jeśli na wszystkich związkach rośnie, to znaczy, że uszkodzony jest pierwszy enzym ponieważ wymaga do wzrostu wszystkich 3 związków
II przypadek: uszkodzony gen b - Jeśli na cytrulinie i argininie rożnie , to enzym drugi jest uszkodzony
III przypadek: uszkodzony gen c - Jeśli rośnie tylko na argininie, to ostatni enzym…
… morfologiczne:
Mutanty ropy (ro):
Dyneina i dynektyna- białka odpowiedzialne za wędrówkę jąder i polaryzację strzępki.
Mutant ro-1 koduje łańcuch ciężki dyneiny
ro-3 koduje białko kompleksu dynektyny
Jeżeli w obrazie mikroskopowym zobaczymy „poplątaną” grzybnię to mamy na pewno do czynienia z uszkodzonym szlakiem dyneiny. 3. Rytm okołodobowy Neurospora crassa:
Tworzenie konidiospor u Neurospora crassa…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)