Ćwiczenie 1
Oznaczanie stężenia białka
Większość metod wymaga rozpuszczonych substancji, takich jak peptydów, białek, białek modyfikowanych potranslacyjnie (np. glikozylowane) lub białek modyfikowanych chemicznie (np. PEG-owanych). Kowalencyjna modyfikacja (glikozylacja lub PEGylacja) może specyficznie oddziaływać z konkretną metodą.
Jeśli nie ma standardu białka do porównania - użyć standardu np. BSA lub IgG (unikać metody Bradford!)
Jeśli nastąpiły modyfikacje potranslacyjne (np. glikozylacja) - unikać metody Bradford i Lowry'ego
Jeśli próbka ma Mcz 8 kDA oraz dużo reszt Tyr i Trp - unikać metody Bradford i pomiaru absorbancji przy 280 nm
(wrócić do Fi.8.1)
Spektroskopia absorbancji UV przy 280 nm:
pochodzi głównie od reszt aromatycznych (tyrozyna i tryptofan) - jeśli więc jest ich mało, może dać błędne wyniki
używane kuwety kwarcowe,
unikać buforów ze składnikami z silną absorbancją UV - detergentów (głównie Triton X-100)
odnośnik - bufor bez białek
jeśli zna się współczynnik ekstynkcji molowej, można skorzystać z prawa Lamberta-Beera:
zakres: 20-300 µg (dla zakresu 1-100 mierzy się przy 205 nm)
Metoda Bradford:
barwnik Coomassie-Blue G-250,
polega na łączeniu się barwnika w kwaśnym pH do reszt argininy, histydyny, phenyloalaniny, tryptofanu i tyrozyny - reakcje hydrofobowe
po związaniu barwnika z białkiem następuje zmiana z 465 do 595 nm (stabilizacja anionowej formy barwnika)
reagenty:
Coomassie Brilliant Blue G-250
etanol
kwas fosforowy
mierzy się absorbancję przy 450 i 595 nm
zalety: łatwośc użycia, wrażliwość, niskie koszty
Metoda Lowry'ego - alkaliczna redukcja miedzi:
dwustopniowa procedura:
reakcja biuretowa: redukcja Cu2+ do Cu+ przez białka w alkalicznym roztworze
(siarczan miedzi jest dodawany do alkalicznego roztworu białka - kolor purpurowo-fioletowy)
redukcja reagenta Folin-Ciocalteu (fosfomolibdenian i fosfowolramian) - niebieski kolor z max absorbancji przy 750 nm
barwa zależna nie tylko od kompleksu (zredukowana miedź-wiązanie amidowe), ale też od reszt tyrozyny, tryptofanu, cystyny, cysteiny i histydyny.
mierzy się absorbancję przy 750 nm
wrażliwa na różne związki towarzyszące
Metoda BCA - kwas bicynchoninowy:
zastąpienie odczynnika Folin-Ciocalteu kwasem bicynchoninowym - zwiększenie wrażliwości i tolerancji na związki przeszkadzające
tworzy się fioletowy kompleks z jonami Cu+ (powstały z Cu2+ i białek)
(…)
… reaktywności): tiol (cysteina), fenolohydroksyl (tyrozyna), amina (lizyna), imidazol (histydyna)
Chlorek dansylu jest raczej wrażliwy na hydrolizę przez wodę i jony hydroksylowe. Grupy aminowe reagują tylko jako wolna zasada (R-NH2), a nie jako sprzężony kwas (R-NH3+), więc oznaczanie musi odbywać się w pH alkalicznym. Identyfikacja dansylowanych aminokwasów:
do analizy DNS-aminokwasów używa się elektroforezy…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)