Ćwiczenia 2: Analiza ilościowa i jakościowa DNA

Nasza ocena:

5
Pobrań: 553
Wyświetleń: 4445
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Ćwiczenia 2: Analiza ilościowa i jakościowa DNA - strona 1 Ćwiczenia 2: Analiza ilościowa i jakościowa DNA - strona 2

Fragment notatki:


Ćwiczenie 2. Analiza ilościowa i jakościowa DNA Po   skończonej   izolacji   DNA   i   przed   wykonaniem   kolejnych   badań   należy   sprawdzić   jakie   jest  stężenie   (ilość)   oraz   czystość   materiału   w   próbie.   Analizę   można   przeprowadzić   za   pomocą  spektrofotometru lub za pomocą rozdziału elektroforetycznego w żelu agarozowym. Mała ilość kwasów  nukleinowych, bądź zanieczyszczenia    mogą    inhibować    reakcje    enzymatyczne    takie    jak    PCR., dlatego ten  etap jest tak ważny. Metodą spektrofotometryczną określa się ilość DNA poprzez pomiar absorpcji badanej próby przy  długościach  fal 260 i 280 nm wobec próby ślepej (roztwór, w którym  rozpuszczone  jest wyizolowane  DNA). Ilość kwasu nukleinowego jest określana jako stężenie w 1 µl. Zakres stężeń, w którym oznaczenie  jest   wiarygodne   to   ok.   10-3000   ng/µl.   Natomiast   czystość   wyizolowanego   DNA   i   stopień   jego  zanieczyszczenia   białkami   określa   stosunek   absorpcji   260/280.   Przyjmuje   się,   że   czyste   DNA  charakteryzuje   się   wartością   260/280   ≥   1,8.   Wartości   poniżej   1,8   świadczą   o   zanieczyszczeniu   próby  białkiem. Analiza   za   pomocą   rozdziału   elektroforetycznego   w   żelu   agarozowym   również   pozwala   na  określenie jakości badanej próby. Jednakże, nie wskazuje ona poziomu zanieczyszczenia próby białkami.  Wskazuje stopień degradacji DNA spowodowany zbyt długim, bądź nieprawidłowym przechowywaniem  prób lub błędami podczas procedury izolacji. Umiejscowienie DNA w elektroforetycznym żelu może być  bezpośrednio oznaczone dzięki obecności bromku etydyny - fluoryzującemu barwnikowi, który wykazuje  powinowactwo do dwuniciowej cząsteczki DNA. Fluorescencja bromku etydyny pozwala również po części  na   oznaczenie   ilości   wyizolowanego   DNA   poprzez   porównanie   z   próbką   o   znanej   zawartości   DNA.  Oznaczone mogą już być prążki zawierające tak małe ilości DNA jak 1-10 ng. Ćwiczenie  ma na celu przeprowadzenie  przez każdego studenta oceny ilościowej i jakościowej za  pomocą spektrofotometru próby DNA wyizolowanej na poprzednich zajęciach. Ocena wyizolowanego DNA za pomocą spektrofotometru (NanoDrop) Lista materiałów  - pipeta  P2 i końcówki. - 100 µl of H2O wolnej od RnaseDNase. - 1.2 µl próby DNA, wyizolowanego na poprzednich ćwiczeniach (użyte będzie 1 µl) - pojemnik na odpady

(…)


- pipeta P2 i końcówki.
- 100 µl of H2O wolnej od RnaseDNase.
- 1.2 µl próby DNA, wyizolowanego na poprzednich ćwiczeniach (użyte będzie 1 µl)
- pojemnik na odpady
- rękawiczki laboratoryjne
Zanim przystąpisz do procedury:
Próbkę DNA przed pomiarem należy rozmrozić i trzymać na lodzie. Bezpośrednio przed pomiarem
zwortexować lub przepipetować góra-dół aby ją dobrze wymieszać.
Procedura
1. Uruchomić…
... zobacz całą notatkę



Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz