To tylko jedna z 2 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Ćwiczenie 2. Analiza ilościowa i jakościowa DNA Po skończonej izolacji DNA i przed wykonaniem kolejnych badań należy sprawdzić jakie jest stężenie (ilość) oraz czystość materiału w próbie. Analizę można przeprowadzić za pomocą spektrofotometru lub za pomocą rozdziału elektroforetycznego w żelu agarozowym. Mała ilość kwasów nukleinowych, bądź zanieczyszczenia mogą inhibować reakcje enzymatyczne takie jak PCR., dlatego ten etap jest tak ważny. Metodą spektrofotometryczną określa się ilość DNA poprzez pomiar absorpcji badanej próby przy długościach fal 260 i 280 nm wobec próby ślepej (roztwór, w którym rozpuszczone jest wyizolowane DNA). Ilość kwasu nukleinowego jest określana jako stężenie w 1 µl. Zakres stężeń, w którym oznaczenie jest wiarygodne to ok. 10-3000 ng/µl. Natomiast czystość wyizolowanego DNA i stopień jego zanieczyszczenia białkami określa stosunek absorpcji 260/280. Przyjmuje się, że czyste DNA charakteryzuje się wartością 260/280 ≥ 1,8. Wartości poniżej 1,8 świadczą o zanieczyszczeniu próby białkiem. Analiza za pomocą rozdziału elektroforetycznego w żelu agarozowym również pozwala na określenie jakości badanej próby. Jednakże, nie wskazuje ona poziomu zanieczyszczenia próby białkami. Wskazuje stopień degradacji DNA spowodowany zbyt długim, bądź nieprawidłowym przechowywaniem prób lub błędami podczas procedury izolacji. Umiejscowienie DNA w elektroforetycznym żelu może być bezpośrednio oznaczone dzięki obecności bromku etydyny - fluoryzującemu barwnikowi, który wykazuje powinowactwo do dwuniciowej cząsteczki DNA. Fluorescencja bromku etydyny pozwala również po części na oznaczenie ilości wyizolowanego DNA poprzez porównanie z próbką o znanej zawartości DNA. Oznaczone mogą już być prążki zawierające tak małe ilości DNA jak 1-10 ng. Ćwiczenie ma na celu przeprowadzenie przez każdego studenta oceny ilościowej i jakościowej za pomocą spektrofotometru próby DNA wyizolowanej na poprzednich zajęciach. Ocena wyizolowanego DNA za pomocą spektrofotometru (NanoDrop) Lista materiałów - pipeta P2 i końcówki. - 100 µl of H2O wolnej od RnaseDNase. - 1.2 µl próby DNA, wyizolowanego na poprzednich ćwiczeniach (użyte będzie 1 µl) - pojemnik na odpady
(…)
…
- pipeta P2 i końcówki.
- 100 µl of H2O wolnej od RnaseDNase.
- 1.2 µl próby DNA, wyizolowanego na poprzednich ćwiczeniach (użyte będzie 1 µl)
- pojemnik na odpady
- rękawiczki laboratoryjne
Zanim przystąpisz do procedury:
Próbkę DNA przed pomiarem należy rozmrozić i trzymać na lodzie. Bezpośrednio przed pomiarem
zwortexować lub przepipetować góra-dół aby ją dobrze wymieszać.
Procedura
1. Uruchomić…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)