To tylko jedna z 2 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
BLOTTING E lektrotransfer jest przenoszony na membrany:
nitrocelulozowe
nylonowe
PVDF
transfer DNA
transfer RNA
transfer białek
Białka rozkładamy na żelu, przykładamy membranę i wszystko przechodzi na membranę, a żel pozostaje czysty. Transfer jest kompletny jak żel będzie całkowicie czysty.
Po transferze następuje detekcja. barwienie Coomasie Brillant Blue, Ponceau S
reakcje specyficzne ze znakowanymi enzymami przeciwciałami i przeprowadzenie reakcji barwnej
reakcje z przeciwciałami znakowanymi izotopami - autoradiografia
hybrydyzacja kwasów nukleinowych /sondy-autoradiografia, fluorescencja/
Detekcja immunologiczna białek metodą Western Blot Mieszanie białek, barwienie na membranie powstają prążki inkubacja z przeciwciałami przeciwciała przyłączają się do jednego, konkretnego białka powinniśmy zobaczyć tylko jeden prążek
Metoda ta pozwala na identyfikację konkretnego białka.
Immunodetekcja białek - reakcje specyficzne z przeciwciałami
Immunoglobuliny znakowane enzymami [HRP,AP] - reakcja barwna
chemiluminiscencja, chemifluorescencja, bioluminescencja - przeciwciała znakowane są enzymem, który przeprowadza taką reakcję w wydzieleniem światła
Immunoglobuliny znakowane izotopami - autoradiografia
Immunoglobuliny znakowane Au
Detekcja kwasów nukle inowych hybrydyzacja - kwasy nukleinowe denaturuje się do postaci jednoniciowej, tworzą się krótkie odcinki komplementarne do danej sekwencji. Odcinki komplementarne są ze znacznikiem - może to być izotop, barwnik fluorescencyjny, biotyna.
detekcja - autoradiografia, fluorescencja, detekcja immunologiczna
ELEKTROFOREZA KAPILARNA - w większości przypadków swobodna (nie zawsze)
Budowa:
źródło wysokiego napięcia (0-30kV)
dwa pojemniki z buforem
dwie elektrody
kapilara
system dozowania próbek
detektor - UV-Vis, fluorescencyjne, MS, elektrochemiczne, NMR
Kapilara - rurka krzemionkowa z otoczką poliamidową; średnica, od 20 do 100 mikrometrów, 50 mikrometrów - najbardziej popularna; długość - 20-100 cm
Przepływ elektroosmotyczny -ścianki - ładunek ujemny
- wnętrze - ściana ładunków dodatnich
Kiedy przykładamy napięcie następuje cały ruch cieczy wymuszony obecnością chmury kationów i wszystkie jony płyną do katody. W detektorze pojawiają się najpierw kationy, potem jony neutralne a na końcu aniony.
Wprowadzanie próbek najczęściej nadciśnienie wpycha płyn do wnętrza
(…)
… za buforem „wiodącym” według malejącej ruchliwości. Składniki próbki dzielą się na jony, które szybciej i wolnej się wydzielają. Kolejność wydzielania: najpierw jony chlorkowe, potem białka i na końcu jony cynowe.
micelarna chromatografia elektrokinetyczna - do buforu dodajemy detergentu (surfaktant - środek powierzchniowo czynny) w stężeniu, które przekracza krytyczne stężenie micelacji. Tworzą się micele- hydrofilowe grupy układają się na zewnątrz miceli, hydrofobowe - wewnątrz. Składniki próbki dzielą się ze względu na stopień hydrofobowości. Po przyłożeniu prądu następuje przepływ elektroosmotyczny do ujemnej elektrody. Micele na zewnątrz mają ładunek ujemny, części hydrofobowe z micelami będą opóźnione w stosunku do cząsteczek rozpuszczonych. Najwcześniej otrzymamy cząsteczki rozpuszczone i neutralne, a potem micele - najdłuższy czas retencji mają te cząsteczki hydrofobowe przyłączone do miceli.
elektrochromatografia kapilarna - kolumna chromatograficzna kapilarna, wypełniona fazą stacjonarną. Oddziałują części hydrofobowe. Przepływ jest wymuszony, przy użyciu prądu. Zjonizowane części niehydrofobowe bardzo szybko przejdą przez kapilarę. W przypadku analitów obdarzonych ładunkiem, wykorzystywana…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)