Konspekt z proteomiki Spis tresci 1. Analiza białek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1. Ultrawirowanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Metody immunologiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. Analiza białek 1.1. Ultrawirowanie Istnieje wiele metod analizy białek. Jednym z najpopularniejszych sposobów jest ultrawirowanie, słuzace do wyznaczania mas czasteczkowych i separacji czasteczek na podstawie róznicy mas. Metoda jest bardzo skuteczna i powszechnie stosowana do rozdzielenia i analizy komórek, organel i i biologicznych makroczasteczek. Pozwala nawet oszacowac masy czasteczkowe dla struktur o niewielkiej masie takich jak struktury subkomórkowe (np. jadro komórkowe, retikulum endoplazmatyczne, rybosomy, mitochondrium) i komórki bakteryjne (np. gronkowiec złocisty, paciorkowiec ropotwórczy, laseczka jadu kiełbasianego, pratek gruzlicy). Informacje te uzyskuje sie analizujac zachowanie sie czasteczki w polu działania siły odsrodkowej. Pole to uzyskuje sie w wirówkach. Czasteczki poruszajac sie po okregu o promieniu r, z predkoscia katowa !2, podlegaja działaniu pola wirowania (przyspieszenia odsrodkowego) równego. Siła wirowania Fc działajaca na ta czasteczke jest równa iloczynowi jej efektywnej masy i pola wirowania. Fc = m0!2r = m(1 %)!2r Efektywna masa m0 jest mniejsza od masy m, poniewaz wyparty płyn wywiera siłe przeciwna. Współczynnik tego wznoszenia wynosi (1 %), gdzie - czastkowa objetosc własciwa czastki (odwrotnosc jej gestosci), % - gestosc roztworu. Czastka w tym polu porusza sie ze stała predkoscia , gdy Fc jest równe sile lepkosci f, gdzie f - współczynnik tarcia czasteczki. W zwiazku z tym szybkosc migracji(szybkosc sedymentacji) czastki wynosi: v = Fc f = m(1%)!2r f Wzór dla ruchu w polu wirowania jest analogiczny z równaniem dla ruchu w polu elektrycznym. Równanie swiadczy, ze szybkosc sedymentacji jest bezposrednio proporcjonalna do przyspieszenia odsrodkowego. Stad mozliwe jest zdefiniowanie miary sedymentacji zaleznej od własciwosci czastki i roztworu. Szybkosc wirowania nie wpływa na szybkosc sedymentacji. Współczynnik sedymentacji s zdefiniowany jak szybkosc podzielona przez przyspieszenie odsrodkowe. s = !2r = m(1%)!2r f Współczynnik sedymentacji wyraza sie go najczesciej w swedbergach (S) i wynosi 1013 sekundy. Stała sedymentacji to stosunek szybkosci sedymentacji (opadania) czastki do przyspieszenia działajacego na te czastke w wirówce Predkosc sedymentacji zalezy od :
(…)
…, toksoplazmozie,
marskosci watroby)
Z których wszystkie przypominaja kształtem litere Y i składaja sie z po dwóch
łancuchów ciezkich i lekkich połaczonymi mostkami dwusiarczkowymi.
Najczesciej do badan wykorzystuje sie klase IgG, poniewaz z tej klasy przeciwciała
sa syntezowane jako białka rozpuszczalne w limfocytach B. Przeciwciała z tej
klasy charakteryzuja sie bardzo wysokim powinowactwem i specyficznoscia…
… lub wyeliminowania czynnika infekcyjnego.
Przeciwciała grupuje sie w kilka klas np.
— IgA (grupa immunoglobulin zawierajacych łancuch ciezki i bioracych udział
głównie w obronie błon sluzowych)
— IgD (sa najmniej zbadanymi immunoglobulinami i ich fizjologiczna funkcja nie
została w pełni wyjasniona. Cechuja sie najwiekszym regionem zawiasowym i
wystepowaniem na niepobudzonych (dziewiczych) limfocytach B…
… z po dwóch
łancuchów ciezkich i lekkich połaczonymi mostkami dwusiarczkowymi.
Najczesciej do badan wykorzystuje sie klase IgG, poniewaz z tej klasy przeciwciała
sa syntezowane jako białka rozpuszczalne w limfocytach B. Przeciwciała z tej
klasy charakteryzuja sie bardzo wysokim powinowactwem i specyficznoscia w stosunku
do odpowiedniego antygenu. Specyficznosc zawdzieczaja rejonowi zmiennemu
czasteczki, który powstaje na drodze rekombinacji. Rozpoznaje i wiaze krótka
sekwencje 5 � 8 aminokwasów na powierzchni antygenu (epitop). Z reguły jeden
antygen powoduje powstanie kilku róznych przeciwciał, które syntezowane sa w
róznych klonach limfocytów B. Przeciwciała te nazywane sa poliklonalnymi i jak
wskazuje nazwa pochodza z wiecej niz jednego klonu komórek plazamtycznych.
Róznia sie miedzy soba składem łancuchów ciezkich i lekkich. Wynika z tego, ze
maja odmienne powinowactwo do epitopów antygenu. Moga sie wiazac do róznych
epitopów i z odmienna siła.
Mozliwe jest jednak wyizolowanie klonów limfocytów B (zazwyczaj zachodzi to u
myszy) i utrzymanie ich w hodowli po fuzji z komórkami nowotworowymi. Powstaja
w ten sposób hybrydoma, zachowujaca zdolnosci immunologiczne limfocytu i
zdolnosc namnazania sie bez…
… ;
— IgG1 i IgG2, wiazace zarówno białko A gronkowca złocistego (Staphylococcus
aureus) oraz białko G paciorkowca, IgG1 pojawiaja sie jako pierwsze w
odpowiedzi odpornosciowej i najsilniej aktywuja dopełniacz;
— IgG3, wiazace jedynie białko G paciorkowca, maja najdłuzszy region zawiasowy
i najsilniej wiaza dopełniacz, choc aktywuja go słabiej niz IgG1;
— IgG4, wiaza zarówno białko A gronkowca, jak i białko…
… przeciwciałami bioracymi udział w
odpowiedzi wtórnej. Charakteryzuje je obecnosc łancucha ciezkiego ;
— IgG1 i IgG2, wiazace zarówno białko A gronkowca złocistego (Staphylococcus
aureus) oraz białko G paciorkowca, IgG1 pojawiaja sie jako pierwsze w
odpowiedzi odpornosciowej i najsilniej aktywuja dopełniacz;
— IgG3, wiazace jedynie białko G paciorkowca, maja najdłuzszy region zawiasowy
i najsilniej wiaza dopełniacz, choc aktywuja go słabiej niz IgG1;
— IgG4, wiaza zarówno białko A gronkowca, jak i białko G paciorkowca, dominuja
w pózniejszych fazach odpowiedzi odpornosciowej.
— IgM (globuliny produkowane przez plazmocyty (komórki układu immunologicznego,
których funkcja jest produkcja i wydzielanie przeciwciał); wzrost miana
IgM u człowieka swiadczy o ostrym procesie chorobowym, np. boreliozie…
… zastosowanie metod
immunologicznych. Przeciwciało (immunoglobuliny, Ig) to białka wytwarzane
przez układ obronny kregowców po zaszczepieniu ich makroczasteczka (antygenem),
taka jak białko które normalnie u nich nie wystepuje.
Przeciwciała maja swoiste powinowactwo do antygenów, które wywołuja synteze.
Efektywnymi antygenami sa białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe. Grupa
rozpoznawana przez przeciwciało…
….
Efektywnymi antygenami sa białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe. Grupa
rozpoznawana przez przeciwciało nazywa sie determinanta antygenowa lub epitopem.
Zwierzeta maja bardzo duza rozmaitosc komórek, a kazda z nich produkuje
przeciwciała o jednej swoistosci. Antygen stymuluje rozmnazanie sie małej liczby
komórek, które wytworzyły komplementarne przeciwciała. Fizjologiczna rola przeciwciała
jest zwiazanie…
… do rozdzielenia białek o róznym współczynniku sedymentacji
jest wirowanie warstwowe (zonalne, zwane równiez wirowaniem w gradiencie gestosci)
jest formowanie w próbce wirówkowej gradientu gestosci przez mieszanie w
róznych proporcjach roztworu o małej gestosci (np. 5% sacharoza) z roztworem o
wiekszej gestosci (np. 20% sacharoza). W tym wypadku gradient gestosci stanowi
zabezpieczenie przed przepływem…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)