BIBLIOTEKI GENOMOWE I GENOWE
Biblioteki genomowe:
Kolekcja klonów z losowymi fragmentami heterologicznego DNA. reprezentują cały genom organizmu (co najmniej jedna kopia każdej sekwencji). Reprezentatywność tj prawdopodobieństwo znalezienia w niej klonu z konkretna sekwencją związana jest z rozmiarem klonowaego DNA, średnią długości wstawek i liczbą klonów.
Wylicza wg wzoru: N= ln(1-P) / ln[1-(I/G)]
N- ilość niezależnych klonów
P- prawdopodobieństwo obecności danej sekwencji w białku (przyjmuje się 99%)
I- średnia dł wstawki w wektorze
G- wielkość genomu
Biblioteka genomowa jest niezastąpiona jeśli szukanym odcinkiem DNA jest np. promotor, enhancer czy inna sekwencja regulacyjna.
Stosowanie jedynego gospodarza ogranicza różnorodność genów ulegających ekspresji, dlatego wykorzystywane są naturalne i zmodyfikowane szczepy. Wybór wektora do tworzenia kolekcji decyduje o właściwościach utworzonego banku.
Typu bibliotek: plazmidowe (np. na pUC18/19), fagowe (na bakteriofagu lambda), kosmidowe, oparte na sztucznych chromosomach (najczęściej stosowane- duża pojemność, stabilność materiału genetycznego, możliwość identyfikacji całych zespołów genów tworzących szlaki metaboliczne)
Wada: trudności w izolacji wektorów BAC (ekstremalnie niska liczba kopii) oraz transformacja nimi komórek gospodarza.
Biblioteki genowe (cDNA)
Z komórek izolowane mRNA i przy uzyciu RT przepisywane na DNA- cDNA.
Wady: kolekcja genów aktywnych transkrypcyjnie w danym momencie i w danej tkance. P
roblemu nie ma, gdy gen jest genem podstawowym i we wsyztkich tkankach ulega ekspresji. Inna wada to reprezentacja w różnych ilościach kopii róznych odcinków cDNA ponieważ nie we wszystkich komórkach transkryptu danego genu będą występowały tak samo licznie.
Zaleta: pewność, że każda cząsteczka cDNA zawiera informacje genetyczną odpowiadającą dokładnie jednemu genowi czyli każdy klon to jeden cały gen. Inną korzyścią jest fakt braku intronów co można wykorzystać kiedy chcemy produkować dana biedako w komórkach bakterii, które normalnie nie przeprowadza splicingu. Różnice między biblioteką genomową a genową:
Genomowa: kolekcja klonów wybranego gatunku
Selekcja rekombinantów w bibliotekach w fagach: technika hybrydyzacyjna.
Cechy bibliotek:
Różnica między klonami tworzącymi kolekcję genomowych sekwencji DNA i klonami CDNA najłatwiej widoczna w przypadku sek pochodzących z tego samego regionu chroosomal DNA. Może on zawierać dwa geny A i B różniące się poziomem transkrypcji, oba zbudowane z egzonów i intonów.
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)