To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Ekstrakcja materiałów biologicznych w wodnych układach dwufazowych.
Cel ćwiczeń:
Zapoznanie się z techniką tworzenia wodnych układów dwufazowych
Próba przeniesienia określonego białka z jednej fazy do drugiej przez modyfikację pH jednej z faz.
Rozdział komórek drożdży w układach dwufazowych
Wykonanie ćwiczeń:
Dokonać rozdziału komórek drożdży w układach ATPS (w dużej probówce szklanej):
Przygotować układy dwufazowe według schematu:
OZNACZENIE AKTYWNOŚCI - AMYLAZY Z DNS:
UWAGA - dotyczy prób do oznaczenia aktywności amylazy:
Nr. układu
Rozc. F. górnej
Rozc. F. dolnej
1 (pH 6)
5 (200ul fazy/800ul H2O)
2 (500ul fazy/500ul H2O)
2 (pH 7,5)
10 (100ul fazy/900ul H2O)
----
3 (pH 9)
20 (50ul fazy/950ul H2O)
----
Wykonanie oznaczenia:
Do 6 średnich probówek rozpipetować po 5ml roztworu skrobi rozpuszczalnej - oznaczyć nr układu i fazę (np.1G, 1D, 2G……) - substrat dla enzymu
Do 12 średnich probówek rozpipetować po 1ml odczynnika DNS - oznaczyć nr układu i fazę (np.1G, 1G, 1D, 1D, 2G……) - odczynnik zatrzymujący reakcję
Wstawić probówki ze skrobią do łaźni wodnej (60oC, jednocześnie podpalić gaz pod garnkiem z wodą) i dodawać kolejno po 500ul każdej z faz w odstępach 1 minutowych - po dodaniu pierwszej włączyć stoper. Po upływie 10 min. rozpocząć pobieranie prób - w odstępach 1 minutowych pobierać dwa razy po 1ml prób do probówek z DNS - probówki od razu wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 min. (garnek z wodą)
Po upływie 10 min. rozpocząć wyjmowanie probówek z łaźni - podobnie jak powyżej w odstępach 1 minutowych - probówki schłodzić we wodzie.
Przed pomiarem na spektrofotometrze do probówek dodać 10ml wody destylowanej, wymieszać i dokonać pomiaru absorbancji przy 530nm wobec próby ślepej (500ul wody+1ml DNS+10mlH2O).
Na podstawie równania krzywej kalibracyjnej obliczyć zawartość glukozy, która powstała w trakcie hydrolizy skrobi:
[C] = Absorbancja /0,80612 [mg/ml]
2.2 Oznaczenie zawartości białka ogólnego metodą Bradford - prób nie rozcieńczać!!!!!
przygotować 7 małych szklanych probówek z 2,5ml odczynnika Bradforda
do przygotowanych probówek dodać po 50ul badanej fazy, a do ostatniej dodać wodę
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)