To tylko jedna z 2 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Laboratorium biochemii
Preparacja DNA z grasicy cielęcej (ćw J)
Cel ćwiczenia
izolacja kwasu dezoksyrybonukleinowego z grasicy cielęcej.
Odczynniki
zamrożona grasica cielęca
1 mM wersenian sodu (EDTA)
roztwór SSC (0.015 M cytrynian sodu, 0.15 M chlorek sodu), pH 7.0
0.15 M cytrynian sodu o pH 7.0
20 % wodny roztwór SDS (dodecylosiarczan sodu) - 4 ml
NaCl - naważka 4 g
mieszanina Savag'a (chloroform : alkohol amylowy = 24 : 1)
95 % zmrożony izopropanol (wydaje asystent tuż przed użyciem)
Szkło i aparatura
deseczka do krojenia grasicy
skalpel
homogenizator
okulary i rękawiczki ochronne
probówki wirówkowe z adapterami
wirówka laboratoryjna
waga techniczna
termostat ustawiony na 55oC
rozdzielacz
zlewki ad. 250 i 400 ml
cylinder miarowy
pipety szklane
pipety Pasteura
bagietki
Wykonanie ćwiczenia
Do naczynia homogenizatora wlano 25 ml roztworu SSC (0.015 M cytrynian sodu, 0.15M NaCl) o pH 7.0 i całość schłodzono w łaźni lodowej,
Zamrożoną grasicę cielęcą pokrojono w 1 cm kawałki, wrzucono do schłodzonego roztworu SSC i homogenizowano przy maksymalnych obrotach przez 20 sekund.
Homogenat przelano do jednej ze schłodzonych w lodówce probówek wirówkowych, drugą z probówek (przeciwwagę) wypełniono wodą.
Probówki zrównoważono względem siebie na wadze technicznej,
Wirowano homogenat przez 13 min. Przy 3500orb./min,
Schłodzono 25ml roztworu SSC
Odrzucono supernatant, a osad DNP rozprowadzono bagietką w 25 ml roztworu SSC, do uzyskania jednolitej zawiesiny
Zawiesinę DNP przelano do probówki wirówkowej i zrównoważono na wadze względem przeciwwagi,
Mieszaninę wirowane przez 13 min przy obrotach 3500/min.
Działania w pkt 7-9 powtórzono dwukrotnie
Supernatant odrzucono, a osad komórkowy przeniesiono do wąskiej i rozprowadzono w 45 ml roztworu 0.15 M cytrynianu sodu o pH 7.0 do uzyskania jednolitej zawiesiny.
Dodano 4 ml 20% siarczanu dodecylu sodu (SDS), Mieszaninę inkubowano w łaźni wodnej w 55ºC przez 15 min., ciągle mieszając,
Dodano 4 g stałego NaCl i kontynuowanoinkubację jeszcze przez 10 min., ciągle mieszając,
Dodano 50 ml mieszaniny Sevag'a
Całość zawiesiny umieszczono w rozdzielaczu i intensywnie wytrząsano przez 10 min.
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)