To tylko jedna z 57 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Zaliczenie 1/2 wykładów (egzamin połówkowy):
15 kwietnia (piątek), godz. 12.15
Osoby które zaliczą egzamin połówkowy będą mogły
zdawać egzamin, obejmujący drugą połowę
wykładów, w terminie zerowym:
10 czerwca (piątek), godz. 12:15
Osoby które nie zaliczą egzaminu połówkowego lub do
niego nie przystąpią, będą zdawały całość w czasie
sesji
BIOCHEMIA
Wykład 3: Poznawanie białek i proteomów
Joanna Cieśla
Genom – źródło informacji w postaci DNA, lista wszystkich
potencjalnych produktów ekspresji genów.
Informacja ta jest jednakowa we wszystkich
komórkach danego organizmu, nie zmienia się
podczas życia. Genom jest statyczny.
Proteom – funkcjonalny przedstawiciel genomu.
Nie stanowi trwałej charakterystyki komórki,
zmienia się wraz z typem komórki, etapem rozwoju
i warunkami środowiska.
Pojęcie proteomu obejmuje wszystkie białka oraz
informacje dotyczące sposobu ich modyfikacji,
funkcjonowania i oddziaływania z innymi cząsteczkami.
Proteom jest znacznie większy od genomu
Oczyszczanie białek
Potrzebny test do oznaczania właściwości identyfikującej białko.
Enzymy – oznaczanie aktywności katalitycznej
Reakcja katalizowana przez dehydrogenazę mleczanową
NADH absorbuje światło przy 340 nm, NAD+ nie
Aktywność enzymu można wyrazić w jednostkach aktywności (np. w ilości
μmoli NADH wytworzonych w czasie 1 min w temp. 30 C).
Aktywność całkowita: całkowita liczba jednostek w preparacie enzymatycznym
Aktywność właściwa: jednostki/mg białka
Gdy stężenie roztworu jest wyrażone w mol/l, a grubość warstwy
jest wyrażona w cm, prawo Lamberta-Baera przyjmuje postać:
A=εlc
c=
A
εl
A – absorbancja
ε – molowy współczynnik absorpcji właściwej (M-1 cm-1)
l – długość drogi świetlnej (cm)
Pomiar w kuwecie o długości drogi świetlnej = 1 cm, objętość końcowa
mieszaniny reakcyjnej = 1 ml, objętość dodawanego preparatu
enzymatycznego = 50 μl.
Dla NADH ε = 6220 M-1cm-1, więc jeśli zmierzona wartość ΔA340 = 0.035/min,
to przyrost NADH będzie wynosił:
rozcieńczenie enzymu w mieszaninie reakcyjnej
c=
0.035 (min-1)
6220 (M-1)
x
106 = 5.62 μmoli/(min x ml) x 20 = 112.4 jednostek/ml
preparatu enzymatycznego
liczba µmoli/min (jednostek) w kuwecie
Izolacja białka z komórki
Homogenizacja i/lub sonifikacja
materiału biologicznego
Wirowanie różnicowe
Białko cytozolowe – wirowanie
20 000 x g przez 20 min.
Supernatant do dalszego
oczyszczania
Monitorowanie oczyszczania białka na każdym etapie
(z 1 l hodowli bakteryjnej)
Oczysz
czenie (x)
1.0
1.0
2.7
1.9
6.2
4.6
Stężenie białka na kolejnych etapach oczyszczania – metody
spektrofotometryczne
Aktywność specyficzna – stosunek całkowitej aktywności
enzymatycznej do całkowitej ilości białka w badanej próbie.
W miarę oczyszczania białka aktywność specyficzna powinna zwiększać się
Wydajność – stosunek całkowitej aktywności na kolejnych etapach do aktywności
wyjściowej
Oczyszczenie – stosunek aktywności specyficznej na kolejnych etapach do
wyjściowej aktywności specyficznej. Wartość ta powinna zwiększać się.
TS
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)