To tylko jedna z 65 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Enzymy – określanie sekwencji i struktury,
„biosynteza” w różnych systemach ekspresyjnych
- poznać funkcję białka
- zrozumieć działanie enzymów w organiźmie
- poznać różnice między enzymami ludzkimi a wirusowymi, lub
bakteryjnymi,
- poznać mutacje wywołujące choroby
- poznać modyfikacje posttranslacyjne białek
Po co sekwencjonować białka?
1. Sekwencje naszego białka można porównać z sekwencjami z
baz danych (czy nasze białko należy do jakiejś rodziny białek?)
2. Można porównać z takim samym białkiem odrębnego
pochodzenia gatunkowego – badania ewolucyjne
3. Poszukać sekwencji wewnętrznie powtórzonych – informacje
na temat historii białka (np. zduplikowany gen pierwotny)
4. Poszukać sekwencji sygnałowych
5. Podstawa do produkcji swoistych przeciwciał
6. Sporządzanie sond DNA ("odwrotna genetyka")
Planowanie procesu oczyszczania białka
Parametry, które trzeba wziąć pod uwagę
ilość potrzebnego białka
- pełna analiza właściwości, ustalanie struktury
- badania kinetyczne-
100-200 mg
5-10 mg
- otrzymanie przeciwciała monoklonalnego
500 µg
- mikrosekwencjonowanie
10 µg
czystość preparatu końcowego
- otrzymywanie przeciwciała monoklonalnego
50%
- otrzymywanie przeciwciała poliklonalnego
99%
- analiza sekwencji
95%
- badania kinetyczne
brak czynników interferujących
zachowanie aktywności biologicznej
- badania kinetyczne
- analiza sekwencji, otrzymywanie przeciwciał
konieczne
nieistotne
koszt
szczególnie ważny przy produkcji przemysłowej
szybkość procesu oczyszczania
ważna przy niestabilnych białkach
Podczas oczyszczania enzymu nale y mierzyć i kontrolować:
1. Stężenie białka
2. Liczbę białek obecnych w preparacie
elektroforeza
3. Aktywność oczyszczanego enzymu
- warunki oznaczenia powinny być optymalne: pH, siła jonowa, wysycające
stężenia substratu(ów) i obecność kofaktorów;
- wybór metody: preferowane techniki spektroskopowe (UV, vis);
metody radiochemiczne – uniwersalne i dokładne ale drogie, pracochłonne i
niebezpieczne;
często stosowane są metody sprzężone;
- w przypadku metod sprzężonych --- ilość enzymu katalizującego reakcję
sprzężoną powinna być na tyle duża, aby reakcja ta nie była etapem
limitującym
zawsze należy stosować oznaczenia kontrolne (tło)
Współczynnik oczyszczania enzymów
Proces wydzielania i oczyszczania danego enzymu często wymaga kilku
metod i etapów
Każdy z etapów oczyszczania zachodzi ze specyficzną wydajnością
i selektywnością
wydajność każdego etapu jest wyrażona liczbą mówiącą, jaki procent
ogólnej wyjściowej aktywności enzymatycznej został odzyskany na
danym etapie oczyszczania,
stopień oczyszczenia enzymu wyraża się przez współczynnik
oczyszczania, czyli stosunek aktywności w aktualnym roztworze do
aktywności w materiale wyjściowym.
Oba te czynniki należy brać pod uwagę podczas procedury oczyszczania,
ponieważ często można uzyskać bardzo wysoki stopień oczyszczenia,
niestety przy niskiej wydajności, albo odwrotnie.
Bilans oczyszczania
Kinaza adenylanowa z tkanki mieśniowej świni
- katalizuje
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)