Podstawy cytochemii i histochemii

Nasza ocena:

3
Pobrań: 98
Wyświetleń: 1687
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Podstawy cytochemii i histochemii - strona 1 Podstawy cytochemii i histochemii - strona 2 Podstawy cytochemii i histochemii - strona 3

Fragment notatki:


6. PODSTAWY CYTOCHEMII I HISTOCHEMII    Histochemia jest to zbiór metod pozwalających na umiejscowienie w komórkach ( cytochemia ) i  tkankach   ( histochemia )   określonych   substancji   chemicznych   oraz   enzymów.   Stanowi  połączenie   metodyki   histologicznej   i   reakcji   chemicznych.   W   odróżnieniu   od   barwienia  histologicznego,   mającego   na   celu   skontrastowanie   struktur   komórkowych   i   tkankowych,  reakcje histochemiczne prowadzą do uwidocznienia w preparacie mikroskopowym jedynie ściśle  określonych substancji lub grup chemicznych, będących przedmiotem badań. Reakcje te cechuje  zatem  specyficzność  ( swoistość ), stanowiąca podstawową własność metodyki histochemicznej.   6.1. Reakcje histochemiczne   6.1.1. Podstawy reakcji histochemicznych   W reakcji histochemicznej dochodzi do oddziaływania pomiędzy wykrywaną substancją,  obecną   w   materiale   biologicznym,   a   wprowadzonymi   do   środowiska   reakcji   związkami  chemicznymi (substratami). Prowadzi to do powstania w miejscach występowania wykrywanej  substancji  produktu reakcji histochemicznej , którego lokalizacja i ilość jest następnie oceniana  w obrazie mikroskopowym. Produkt ten musi spełniać dwa podstawowe warunki:  musi być widoczny w obrazie mikroskopowym (tzn. barwny, fluoryzujący lub elektronowo  gęsty);   powinien być  nierozpuszczalny w środowisku reakcji (prawie zawsze jest to środowisko  wodne), aby nie dopuścić do jego dyfuzji z miejsca powstania do otoczenia i w konsekwencji do  zatarcia pierwotnej lokalizacji. Do   końcowej   oceny   reakcji   histochemicznych   można   użyć   -   w   zależności   od  zastosowanej metodyki - wszystkich typów mikroskopów świetlnych i elektronowych.   6.1.2. Typy reakcji histochemicznych   Wykrywanie  określonych  substancji lub grup chemicznych  w komórkach i tkankach  opiera się na kilku zasadniczych typach reakcji histochemicznych:  bezpośrednia reakcja wykrywanej substancji lub grupy z substratem, prowadząca do powstania  produktu wyznaczającego miejsce jej lokalizacji (np. reakcja z dwunitrobenzenem wykrywająca  reszty tyrozynowe białek);  reakcja dwu- lub kilkuetapowa, w której wstępnie dochodzi do zmiany struktury chemicznej  wykrywanej substancji, a następnie ten zmieniony związek chemiczny wykrywany jest przez  przeprowadzenie końcowej reakcji barwnej (np. tworzenie grup aldehydowych w wielocukrach  pod wpływem utlenienia i ich następowe uwidocznienie odczynnikiem Schiffa w reakcji P.A.S.);

(…)

…. Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie świetlnym
Zatapianie w parafinie materiału przeznaczonego do badań histochemicznych może być
stosowane przede wszystkim w przypadku wykrywania białek, kwasów nukleinowych i
cukrowców, gdyż powoduje wypłukanie i utratę lipidów oraz inaktywację prawie wszystkich
enzymów.
Przy wykrywaniu amin biogennych metodą z wyboru jest liofilizacja tkanki i utrwalenie
w parach formaldehydu. Liofilizacja jest również chętnie stosowana przy wykrywaniu glikogenu
i innych cukrowców. Materiał liofilizowany zatapia się w parafinie.
W badaniach histochemicznych bardzo często korzysta się z techniki mrożeniowej
(skrawki kriostatowe), która w razie potrzeby pozwala na uzyskanie skrawków z materiału nie
utrwalonego, a ponadto zachowuje w skrawanej tkance wszystkie zawarte…
… się na reakcjach barwnych z
resztami określonych aminokwasów. Należą tu m.in.:
 reakcja Millona z kwasem azotowym, azotanem rtęci i azotanem sodu (wykrywa reszty
tyrozyny),
reakcja z dwunitrofluorobenzenem (wykrywa reszty tyrozyny, -SH i -NH ,
2
reakcja z naftolo-etylenodwuaminą (wykrywa reszty tryptofanu),
reakcja z dwuchloronaftolem (wykrywa reszty argininy),
reakcja z błękitem rtęciowo-bromofenolowym…
… się z RNA. Efektem procedury jest zatem czerwone zabarwienie rejonów komórki
bogatych w RNA (jąderko, obszary chromatyny obfitujące w rybosomy) i zielono-fioletowy
odcień chromatyny jądrowej (wynikający z nałożenia się barw DNA i RNA). Metoda Bracheta
zakłada każdorazową kontrolę barwienia przez wytrawienie części skrawków rybonukleazą.
Powoduje to zniknięcie czerwonych (pyroninochłonnych) struktur i zachowanie tylko
zabarwionej na zielono chromatyny.
Klasyczne metody histochemiczne umożliwiają jedynie ogólne wykrywanie kwasów
nukleinowych. Identyfikację ich odcinków charakteryzujących się ściśle określoną sekwencją
nukleotydów zapewnia znacznie bardziej swoista hybrydocytochemia (p. rozdz. 8)
6.6.3. Metody fluorescencyjne
W
ostatnich
latach
dużą
popularność
zyskało
wykorzystanie
barwników…
… należy szereg niskocząsteczkowych, aktywnych biologicznie
związków o charakterze hormonów lub neuromediatorów (adrenalina, noradrenalina, serotonina,
dopamina, itp.). Metodą z wyboru przy ich wykrywaniu na poziomie mikroskopu optycznego
jest liofilizacja tkanki, a następnie inkubacja liofilizowanego materiału w parach
formaldehydu w podwyższonej temperaturze (ok. 80°C). Etap ten łączy w sobie proces…
… enzymów).
6.8.2. Reakcja precypitacji z kationami metali (reakcja Gomoriego)
Służy do wykrywania hydrolaz. Reakcja polega na wstępnym rozszczepieniu substratu
przez wykrywany enzym obecny w tkance, a następnie na wytrąceniu jednej ze składowych
rozszczepionego substratu jonami metali (Ca , Pb , Cu , Ba , Co ), które utworzą z nią
2+
2+
2+
2+
2+
nierozpuszczalną sól (ryc. 6.5). Większość takich soli…
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz