Immunohistochemia - ogólne zagadnienia

Nasza ocena:

3
Pobrań: 224
Wyświetleń: 1911
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Immunohistochemia - ogólne zagadnienia - strona 1 Immunohistochemia - ogólne zagadnienia - strona 2 Immunohistochemia - ogólne zagadnienia - strona 3

Fragment notatki:


7. PODSTAWY IMMUNOHISTOCHEMII Najwyższą  swoistością  charakteryzują  się  te   oddziaływania  między  związkami  chemicznymi,  które polegają na wzajemnym "dopasowaniu" przestrzennym wiążących się ze sobą cząsteczek.  Są   to   tzw.   oddziaływania   stereospecyficzne ,   w   wyniku   których   nie   tworzą   się   wiązania  kowalencyjne, natomiast cząsteczki łączą się ze sobą za pośrednictwem słabych, lecz licznych  wiązań   wynikających   z   bliskości   atomów   "dopasowanych"   do   siebie   cząsteczek   (wiązania  wodorowe, elektrostatyczne, siły van der Waalsa). W ten sposób dochodzi do połączenia między  antygenem   i   przeciwciałem,   między   zasadami   purynowymi   i   pirymidynowymi   w   kwasach  nukleinowych, czy między cukrowcami i niektórymi glikoproteidami. Techniki histochemiczne  wykorzystujące  ten  charakter   połączeń noszą  zbiorczą nazwę   histochemii  powinowactwa   i  cechują się najwyższym stopniem specyficzności spośród wszystkich metod histochemicznych.  Do   histochemii   powinowactwa   należą:   immunohistochemia,   histochemia   lektyn   i  hybrydocytochemia (p. rozdz. 8). Immunohistochemia   zajmuje  się   wykrywaniem  w   komórkach   (immunocytochemia)   i  tkankach substancji o charakterze antygenowym za pomocą znakowanych przeciwciał.  7.1. Antygen i przeciwciało Antygen  jest to substancja (zazwyczaj białko, gliko-, lipo- lub nukleoproteid, rzadziej związek o  niższej masie cząsteczkowej), wykazująca:   zdolność   do   wywołania   produkcji   swoistych   przeciwciał   przez   system   immunologiczny  organizmu ( immunogenność ); 121  zdolność do swoistego wiązania wytworzonych przeciwciał i do tworzenia z nimi kompleksów  ( antygenowość ). Przeciwciało   jest   to   białko   należące   do   klasy   immunoglobulin ,   wytwarzane   przez  system  immunologiczny  organizmu  i  mające  zdolność   swoistego   wiązania  się  z   antygenem.  Cząsteczka przeciwciała ma kształt litery Y i składa się z 2 ciężkich i 2 lekkich łańcuchów  polipeptydowych.   W   wyniku   trawienia   enzymem   proteolitycznym   papainą,   cząsteczka  przeciwciała rozpada się na  fragment Fc  oraz dwa jednakowe  fragmenty Fab , które zawierają  miejsca wiążące antygen (ryc. 7.1).  Fragmenty  Fab  rozpoznają   i  wiążą   się   jedynie  z   niewielkim  fragmentem  cząsteczki  antygenu (kilka-kilkanaście aminokwasów w przypadku białek), który nazywamy 

(…)

… na poziomie mikroskopu świetlnego i elektronowego)
metalami (badania na poziomie mikroskopu elektronowego).
7.3.1. Znakowanie fluorochromami
Metody
immunohistochemiczne
wykorzystujące
przeciwciała
znakowane
fluorochromami noszą nazwę immunofluorescencji. W praktyce stosuje się najczęściej
następujące fluorochromy:
izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) - zielona fluorescencja,
tetrametylo-izotiocyjanian…

na
wykorzystanie
ferrytyny
jako
immunohistochemicznych na poziomie mikroskopu elektronowego.
znacznika
do
badań
Znakowanie przeciwciał
ferrytyną przeprowadza się również za pośrednictwem dwufunkcyjnych związków chemicznych.
7.3.4. Znakowanie koloidalnym złotem
W badaniach immunohistochemicznych na poziomie mikroskopu elektronowego
najczęściej stosuje się przeciwciała znakowane koloidalnym złotem, czyli otrzymanymi poprzez
odpowiednią preparatykę chemiczną (złoto wiąże się z hydrofobowymi obszarami cząsteczki
przeciwciała) mikroskopijnymi ziarenkami metalicznego złota (średnica od 5 do 40 nm). Z uwagi
na wysoką liczbę atomową złota są one widoczne w mikroskopie elektronowym w postaci
126
kontrastowych, czarnych punktów, wyraźnie lokalizujących miejsce związania znakowanego
przeciwciała z tkanką.
Znakowanie…
…:
kontrolowane trawienie skrawków przy użyciu enzymów proteolitycznych (trypsyna, pronaza)
działanie na skrawki mikrofalami.
Rodzaj postępowania i jego intensywność (rodzaj i stężenie enzymu, czas trawienia lub
ekspozycji na mikrofale) zależą w szerokim zakresie od charakteru antygenu i materiału, należy je
zatem w każdym przypadku dobrać doświadczalnie.
7.5. Wykonanie reakcji immunohistochemicznej
7.5.1…

akrylowe wykazują słabsze własności wiążące i maskujące miejsca antygenowe, a także
pozwalają na swobodniejszą penetrację znakowanych przeciwciał w głąb skrawka. Z tego
powodu używa się ich teraz powszechnie do zatapiania materiału, który ma być przedmiotem
badań immunohistochemicznych w mikroskopie elektronowym.
131
Do reakcji immunohistochemicznych ultracienkie skrawki powinny być zbierane na siatki…
… końcowa reakcja
histochemiczna prowadzi do nagromadzenia znacznych ilości barwnego produktu reakcji.
Do znakowania przeciwciał używa się kilku enzymów, z których najpowszechniej
stosowane to peroksydaza i fosfataza zasadowa.
Znakowanie przeciwciał enzymami polega na ich chemicznym sprzęganiu za
pośrednictwem związków dwufunkcyjnych, czyli posiadających dwie grupy wiążące, z których
jedna przyłącza…
… na poziomie mikroskopu optycznego jak i elektronowego.
Obecnie istnieje jednak możliwość wykrywania wielu natygenów na skrawkach parafinowych
(udało się uzyskać przeciwciała przeciw takim miejscom antygenowym, które nie ulegają
deformacji pod wpływem procesu zatapiania w parafinie).
W przypadku mikroskopii elektronowej skrawki materiału zatopionego w żywicach
epoksydowych zasadniczo nie nadają się do badań…
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz