To tylko jedna z 21 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
7. PODSTAWY IMMUNOHISTOCHEMII Najwyższą swoistością charakteryzują się te oddziaływania między związkami chemicznymi, które polegają na wzajemnym "dopasowaniu" przestrzennym wiążących się ze sobą cząsteczek. Są to tzw. oddziaływania stereospecyficzne , w wyniku których nie tworzą się wiązania kowalencyjne, natomiast cząsteczki łączą się ze sobą za pośrednictwem słabych, lecz licznych wiązań wynikających z bliskości atomów "dopasowanych" do siebie cząsteczek (wiązania wodorowe, elektrostatyczne, siły van der Waalsa). W ten sposób dochodzi do połączenia między antygenem i przeciwciałem, między zasadami purynowymi i pirymidynowymi w kwasach nukleinowych, czy między cukrowcami i niektórymi glikoproteidami. Techniki histochemiczne wykorzystujące ten charakter połączeń noszą zbiorczą nazwę histochemii powinowactwa i cechują się najwyższym stopniem specyficzności spośród wszystkich metod histochemicznych. Do histochemii powinowactwa należą: immunohistochemia, histochemia lektyn i hybrydocytochemia (p. rozdz. 8). Immunohistochemia zajmuje się wykrywaniem w komórkach (immunocytochemia) i tkankach substancji o charakterze antygenowym za pomocą znakowanych przeciwciał. 7.1. Antygen i przeciwciało Antygen jest to substancja (zazwyczaj białko, gliko-, lipo- lub nukleoproteid, rzadziej związek o niższej masie cząsteczkowej), wykazująca: zdolność do wywołania produkcji swoistych przeciwciał przez system immunologiczny organizmu ( immunogenność ); 121 zdolność do swoistego wiązania wytworzonych przeciwciał i do tworzenia z nimi kompleksów ( antygenowość ). Przeciwciało jest to białko należące do klasy immunoglobulin , wytwarzane przez system immunologiczny organizmu i mające zdolność swoistego wiązania się z antygenem. Cząsteczka przeciwciała ma kształt litery Y i składa się z 2 ciężkich i 2 lekkich łańcuchów polipeptydowych. W wyniku trawienia enzymem proteolitycznym papainą, cząsteczka przeciwciała rozpada się na fragment Fc oraz dwa jednakowe fragmenty Fab , które zawierają miejsca wiążące antygen (ryc. 7.1). Fragmenty Fab rozpoznają i wiążą się jedynie z niewielkim fragmentem cząsteczki antygenu (kilka-kilkanaście aminokwasów w przypadku białek), który nazywamy
(…)
… na poziomie mikroskopu świetlnego i elektronowego)
metalami (badania na poziomie mikroskopu elektronowego).
7.3.1. Znakowanie fluorochromami
Metody
immunohistochemiczne
wykorzystujące
przeciwciała
znakowane
fluorochromami noszą nazwę immunofluorescencji. W praktyce stosuje się najczęściej
następujące fluorochromy:
izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) - zielona fluorescencja,
tetrametylo-izotiocyjanian…
…
na
wykorzystanie
ferrytyny
jako
immunohistochemicznych na poziomie mikroskopu elektronowego.
znacznika
do
badań
Znakowanie przeciwciał
ferrytyną przeprowadza się również za pośrednictwem dwufunkcyjnych związków chemicznych.
7.3.4. Znakowanie koloidalnym złotem
W badaniach immunohistochemicznych na poziomie mikroskopu elektronowego
najczęściej stosuje się przeciwciała znakowane koloidalnym złotem, czyli otrzymanymi poprzez
odpowiednią preparatykę chemiczną (złoto wiąże się z hydrofobowymi obszarami cząsteczki
przeciwciała) mikroskopijnymi ziarenkami metalicznego złota (średnica od 5 do 40 nm). Z uwagi
na wysoką liczbę atomową złota są one widoczne w mikroskopie elektronowym w postaci
126
kontrastowych, czarnych punktów, wyraźnie lokalizujących miejsce związania znakowanego
przeciwciała z tkanką.
Znakowanie…
…:
kontrolowane trawienie skrawków przy użyciu enzymów proteolitycznych (trypsyna, pronaza)
działanie na skrawki mikrofalami.
Rodzaj postępowania i jego intensywność (rodzaj i stężenie enzymu, czas trawienia lub
ekspozycji na mikrofale) zależą w szerokim zakresie od charakteru antygenu i materiału, należy je
zatem w każdym przypadku dobrać doświadczalnie.
7.5. Wykonanie reakcji immunohistochemicznej
7.5.1…
…
akrylowe wykazują słabsze własności wiążące i maskujące miejsca antygenowe, a także
pozwalają na swobodniejszą penetrację znakowanych przeciwciał w głąb skrawka. Z tego
powodu używa się ich teraz powszechnie do zatapiania materiału, który ma być przedmiotem
badań immunohistochemicznych w mikroskopie elektronowym.
131
Do reakcji immunohistochemicznych ultracienkie skrawki powinny być zbierane na siatki…
… końcowa reakcja
histochemiczna prowadzi do nagromadzenia znacznych ilości barwnego produktu reakcji.
Do znakowania przeciwciał używa się kilku enzymów, z których najpowszechniej
stosowane to peroksydaza i fosfataza zasadowa.
Znakowanie przeciwciał enzymami polega na ich chemicznym sprzęganiu za
pośrednictwem związków dwufunkcyjnych, czyli posiadających dwie grupy wiążące, z których
jedna przyłącza…
… na poziomie mikroskopu optycznego jak i elektronowego.
Obecnie istnieje jednak możliwość wykrywania wielu natygenów na skrawkach parafinowych
(udało się uzyskać przeciwciała przeciw takim miejscom antygenowym, które nie ulegają
deformacji pod wpływem procesu zatapiania w parafinie).
W przypadku mikroskopii elektronowej skrawki materiału zatopionego w żywicach
epoksydowych zasadniczo nie nadają się do badań…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)