To tylko jedna z 11 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Techniki Histologiczne Procedury przygotowywaia skrawków: pobieranie materiału utrwalanie zatapianie krojenie barwienie Skrawki mogą pochodzić od osób żywych (biopsja), martwych (ustalanie przyczyny zgonu) lub od zwierząt laboratoryjnych. UTRWALANIE Powoduje występowanie śmierci kom poprzez zahamowaie ich procesów życiowych. Najlepszym utrwalaczem – ten co najszybciej zahamuje te procesy – zapobiega to autolizie (samotrawienie kom pod wpływem własnych zawartych w kom enzymów) Proces utrwalanie hamuje synteze i przemiany wszystkich subst budujących kom tj. białek i lipidów, węglowodanów, kw. nukleinowych i in. Najważniejsze jednak zmiany wyst w cząsteczkach białek, które ulegają procesom koagulacji i denaturacji Koagulacja – związ z usuwaniem przez utrwalacz wodnej otoczki otaczającej białka co powoduje ich wytrącenie (proc. odwracalny) Denaturacja – zmiana II- i III-rzędowej struktury białek (traci otoczkę wodną i staje się białkiem włókienkowym); likwidacja lub rozluźnienie wiązań – powstałe po denaturacji białka linearne zmieniają swą strukturę co powoduje w efekcie utrate ich aktywności biol. Utrwalenie lipidów – tylko poprzez zmianę ich struktury chem ( np. ich nierozpuszczalne sole) ; najczęściej stosowane utrwalacze powodują wypłukanie tłuszczy przez zastosowane do utrwalania i zatapiania związki org m.in. alkohole, benzeny; w kom tych pozostają wakuole po lipidach Węglowodany – wielkocząsteczkowe - utrwalenie po zastosowaniu utrwalaczy bezwodnych m.in. płynu Carnoy’a ; niskocząsteczkowe - praktycznie niemożliwe Białke enzymatyczne – te utrwalacze co w małym stopniu je denaturują np. aceton, glutaraldehyd, formaldehyd, Chromatyna – płyn Carnoy’a lub Bouin’a Stosunek ilościowy tkanki do utrwalacza : 1:20 Objętość tkanki nie powinna przekraczać 1cm3 Utrwalacze proste: 1. FORMALINA – formaldehyd (ald. mrówkowy) , używa się r-ru 4% (przechowywac w ciemnym naczyniu, aby zapobiec rozkładowi Powszechnie stosowana z powodu niskich kosztów, dobrych wyników utrwalania i trwałości stosowania. Do utrwalania stosować r-ry zobojętnionej formaliny. Szybko przenika wgłąb taknek, dobrze ścina białko, zachowuje w kom lipidy, węglowodany ulegają wypłukaniu. Tak utrwalone prep można długo przechowywać. 2. ALKOHOL ETYLOWY – szybko wytrąca białko, glikogen, subst. śluzowe, ale rozpuszcza lipidy. stosuje się rzadko jako samodzielny utrwalacz – najczęściej zastosow razem z
(…)
…:
-odwapnianie kości – rozpuszczenie fosforanów wapnia; wykonywane po zastosowaniu
kwasów nieorg. np. azotowego lub org. np. trójchlorooctowego;
Dobre wyniki również po zastosowaniu mieszaniny formaliny i EDTA (wersenian sodu)
w stosunku 1:1; mieszanina ta oprócz właściwości odwapniających utrwala materiał nie
zmieniając stęż. jonów wodorowych.
-zatopienie materiału w parafinie i krojenie na skrawki…
… liofilizacja ->liofilizacja właściwa zastąpiona
działaniem etanolu, metanolu, acetonu w temp -20-60oC w celu rozpuszczenie
pozostałych mikrokryształków lodu
ODWADNIANIE
po utrwaleniu
poprzez umieszczanie badanego materiału we wzrastających stężeniach np. alkoholu od
70-100% (szereg alkoholowy) -> należy całkowicie usunąć wodę ponieważ ani parafina,
ani celoidyna ani też żywice syntetyczne nie rozpuszczają się w wodzie.
ZATAPIANIE
najczęściej zatapia się w parafinie
czasem mieszaniny parafiny z różnymi polimerami np. preparat Paraplast
nadanie odpowiedniej twardości i homogenności ułatwiającej krojenie.
KROJENIE
mikrotomy
m. saneczkowe lub obrotowe kroją na grubość ok. 2-6µm
do krojenie skrawków nie utrwalonych – specjalne mikrotomy wbudowane dokomór
chłodzących w temp. -20oC (kriostaty)
mikrotomy…
… jest
szerzeniem się metalowej sztabki pod wpływem ciepła
BARWIENIE
skrawki parafinowe przez barwwoieniem musza być odparafinowane -> umieszczone w
benzenie lub ksylenie.
jeżeli skrawki będą barwione r-rami wodnymi wówczas należy je nawodnić poprzez
przeprowadzenie naklejonych na szkiełko podstawowe preparatów przez malejący szereg
alkoholi (od 100 do 70%)
po przeprowadzonym barwieniu preparaty należy…
…
WYKRYWANIA ANTYGENÓW (MET. PAP)
Preparaty powinny być utrwalone w płynie Bouina
Wykonanie reakcji:
1. odparaf., blokować endogenną peroksydazę przy pomocy 0,5% wody utlenionej w
metanolu.
2. umieścic prep. w normalnej surowicy zwierzęcia od którego pochodzi swoista p-ciało w
rozcieńczeniu 1:10 w celu blokowania nieswoistego wiązania.
3. nanieśc na prep. swoiste p-ciało (skierowane przeciw antygenowi…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)