Oczyszczanie kwasow nukleinowych

Nasza ocena:

5
Pobrań: 217
Wyświetleń: 861
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Oczyszczanie kwasow nukleinowych - strona 1 Oczyszczanie kwasow nukleinowych - strona 2 Oczyszczanie kwasow nukleinowych - strona 3

Fragment notatki:

Analiza próbek spożywczych na zawartość
Genetycznie Modyfikowanych Organizmów
Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA
M. Somma
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Izolacja i oczyszczanie DNA
2
Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA
Wstęp
3
Metody izolacji kwasów nukleinowych
4
Metody oczyszczania kwasów nukleinowych
5
Metoda CTAB
7
Oznaczanie ilości DNA metodą spektrofotometryczną
10
Zasady spektrofotometrycznego pomiaru stężeń DNA
11
Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych
12
Część eksperymentalna
15
Literatura
19
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów
Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA
3
Wstęp
Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych jest pierwszym etapem większości
procedur stosowanych w biologii molekularnej, jak też we wszystkich technikach
inżynierii genetycznej. Podstawowym celem tego etapu prac jest uzyskanie czystego
materiału, bez względu na źródło jego pochodzenia, z przeznaczeniem na
przeprowadzenie specyficznych analiz metodą łańcuchowej reakcji polimerazy
(PCR), w celu wykrycia genetycznych modyfikacji (GM). Jakość i czystość kwasów
nukleinowych jest czynnikiem silnie wpływającym na wynik reakcji PCR. Aby
ograniczyć obecność inhibitorów reakcji PCR, należy użyć właściwą metodę izolacji
kwasów nukleinowych. Lista możliwych inhibitorów reakcji PCR jest przedstawiona w
Tabeli 1. W celu zapobieżenia fałszywie-negatywnym wynikom należy sprawdzić
matrycę. W tym celu trzeba użyć specyficznych próbek dających pozytywny wynik
PCR, w przypadku gdy inhibicja nie ma miejsca. Do tego celu wykorzystuje się
roślinno-specyficzne (eukariotyczne lub chloroplastowe) lub gatunkowo-specyficzne
analizy PCR.
Tabela 1. Niektóre inhibitory reakcji PCR
Inhibitor
Inhibujące stężenie
SDS
0,005%
Fenol
0,2%
Etanol
1%
Izopropanol
1%
Octan sodu
5 mM
Chlorek sodu
25 mM
EDTA
0,5 mM
Hemoglobina
1 mg/ml
Heparyna
0,15 i. m/ml
Mocznik
20 mM
Mieszanina reakcyjna
15%
Istnieje wiele metod izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych. Wybór
najwłaściwszej i najbardziej odpowiedniej metody dla konkretnych wymagań zależy
od:

Analizowanego kwasu nukleinowego
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów
Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA
4

Organizmu z jakiego przeprowadzamy izolację kwasu nukleinowego

Rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy izolację (rodzaj tkanki, organ,
stopień przetworzenia, itd.)

Oczekiwanych
rezultatów
(plon,
czystość,
czas
przeznaczony
na
oczyszczanie)

Docelowego przeznaczenia materiału (PCR, klonowanie, znakowanie,
blotowanie, Real Time-PCR, synteza cDNA)
Zasady niektórych metod stosowanych obecnie do izolacji i oczyszczania
kwasów nukleinowych przedstawione są w następnych

(…)

… główkami
(heads) i hydrofobowych końcówek zwanych ogonkami (tails). W metodzie CTAB,
lizę błon komórkowych przeprowadza się poprzez przez użycie detergentu
(CTAB) zawartego w buforze ekstrakcyjnym.
Ze względu na podobną budowę warstwy lipidowej i detergentu, CTAB jako
składnik
buforu
ekstrakcyjnego
pełni
funkcję
wychwytywania
tłuszczów
wchodzących w skład błon komórkowych i błony jądrowej. Mechanizm…
… (np. proteinaza K)
Często w jednym etapie procedury rozrywa się błony komórkowe i inaktywuje
wewnątrzkomórkowe nukleazy. Przykładowo jeden roztwór może zawierać
detergenty
rozpuszczające
błony
komórkowe
i
silnie
chaotropowe
sole
inaktywujące wewnątrzkomórkowe enzymy. Po lizie komórek i inaktywacji
nukleaz, pozostałości struktur komórkowych mogą być łatwo usunięte poprzez
filtrację czy wytrącanie…
… mogą wykorzystywać różne techniki rozdziału
jak filtracja w żelu, wymiana jonowa, selektywna adsorpcja, rozdział oparty na
powinowactwie (affinity binding).
Podczas filtracji w żelu wykorzystywana jest porowata struktura cząsteczek żelu i
jej właściwości rozdziału cząsteczek o różnej wielkości. Matriks żelu o
zdefiniowanej wielkości porów umożliwia mniejszym cząsteczkom wniknięcie do
porów na zasadzie dyfuzji…
… jest z inną metodą. Przykładem może być wirowanie kolumn
chromatograficznych, które łączy filtrację w żelu i wirowanie w celu oczyszczenia
DNA i RNA z mniejszych zanieczyszczeń (soli, nukleotydów, itp.) z wymianą
jonową i selekcją pod względem wielkości cząsteczki, gdzie filtracja w żelu
łączona jest z wirowaniem w celu oczyszczenia DNA i RNA z mniejszych
zanieczyszczeń (soli, nukleotydów, itp). Niektóre…
… komórkowych. Jak wcześniej zaznaczono, pierwszy etap izolacji DNA
obejmuje rozerwanie struktur komórkowych – ściany komórkowej i błony
jądrowej. W tym celu próbka jest homogenizowana i w pierwszej kolejności
traktowana buforem ekstrakcyjnym zawierającym EDTA, Tris/HCl i CTAB.
Wszystkie błony biologiczne mają podobną ogólną budowę, i zawierają
cząsteczki tłuszczów i białek utrzymujących się razem…
… będzie przedstawiony w następnych podrozdziałach
(Zimmerman i in., 1998).
Izolacja/wytrącanie
Ekstrakcja
rozpuszczalnikowa
jest
często
wykorzystywana
do
eliminacji
zanieczyszczeń kwasów nukleinowych. Przykładowo metoda oparta na ekstrakcji
mieszaniną
fenolu
i
chloroformu
jest
wykorzystywana
do
usuwania
zanieczyszczeń białkowych. Wytrącanie przy użyciu izopropanolu czy etanolu jest
stosowane w celu koncentracji kwasów…
... zobacz całą notatkę



Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz