(Gdy znaleźliśmy sekwencje to nie jest cała sprawa, bo musimy teraz napisać funkcje tej sekwencji. )Kiedy poznano genom drożdży można było też opisać gen, przypisać sekwencji znaczenie genu I określono 6 tysięcy ,z tego dla około połowy można było przypisać punkty ,czyli ten stopień (wydaje się na tyle ważny ,albo oczywisty ,że gdy określamy sekwencje genu to od razu wiemy jak ona wygląda. Otóż nie! To są dwie niezależne sprawy, dwa jakby niezależne problemy. A więc w jaki sposób identyfikuje się sekwencje genu w sekwencji poznanej genomu(otrzymanej sekwencji genomu) . Najprostszym sposobem jest sposób, w którym wykorzystujemy sekwencje białka ,jeśli mamy informacje o 1 rzędowym białku to naturalnie przetransponowanie jej na sekwencje cDNA jest dość proste i wtedy można wyłowić z całej informacji tą która odpowiadania sekwencji cDNA. Jeśli nie posiadamy takiej informacji o 1-rzędowej strukturze białka musimy w jakiś inny sposób tą sekwencje genu określić, jest to proste, otóż i tak i nie. Zacznijmy od tego ,że przypomnijmy sobie iż DNA horrendalne(?) może być odczytane na 6 sposobów jako ramka odczytu . Zarówno 1 jak i 2 nić może być odczytana niezależnie ,dlatego otrzymujemy 3 różne ramki odczytu . Oskanowanie sekwencji czy odczytywanie sekwencji może być robione przez patrzenie na sekwencje ale jest to uciążliwe , więc robi się te analizy przy użyciu technik bioinformatycznych. Zatem jak określić ramkę odczytu? Są tu możliwe 2 różne strategie: 1- dotyczą odczytu ramek genów prokariotycznych ,sytuacja prosta . Otóż z analiz statystycznych można określić jaka jest średnia długość ramki odczytu dla różnych genów np. dla E.coli jest 317 kodonów, dla Saccharomyces 483 a dla człowieka 450 kodony i wychodząc z tej informacji można poszukiwać ramki odczytu w genomach prokariotycznych. Po prostu analizuje się wszystkie możliwe ramki odczytu, rozpoczynając od szukania przesuniecia i szuka się tych które są dostatecznie długie ,ich długość będzie odpowiadała temu co wiemy o ramkach odczytu prokariotycznych. Trzeba zauważyć ,że jak sekwencja nie jest czytana w ramce odczytu to pojawiają się kodony stopu i te kodony są tak nagromadzone iż ramki odczytu które są generowane przez te kodony stopu to te ramki są bardzo krótkie . Jeżeli zaczniemy czytać ramke właściwą to kodon stopu nie pojawia się zbyt często. (cos tam o schemacie) To znaczy ,że mamy coś to nie jest ramką odczytu wobec ramki odczytu która była podana wcześniej bo odpowiednią ramką odczytu E.coli jest 317 kodonów. Takie czytania dokonuje się przy minimalnie 100 kodonach dla genów prokariotycznych. Zwykle te odczyty właśnie prowadzą do takich wyników które są pokazane, przy różnym rozpoczęci odczytywania, otrzymuje się długie i krótkie ramki odczytu. W przypadku prokariotycznego genomu poszukiwanie ramek jest proste, bo pomiędzy genami sekwencje Intergenowe są bardzo krótkie tak że ten punkt informacyjny dodatkowy jest bardzo nieznaczący. Dlatego dla genomu prokariotycznego zwykły skaning wystarcza aby znaleźć właściwe sekwencje genu.
(…)
… zastępczą i ostatecznie otrzymuje się linię, które są homocytotyczne (dwa allele). Badanie transkryptomu. Transkryptom to efekt ekspresji genów. Jak można go poznać? Złym pomysłem jest sporządzenie biblioteki cDNA. Jakościowa wiedza, czyli które geny, jakie są transkrybowane, a ilościowa w jakim stopniu są transkrybowane, których więcej, których mniej. Pierwsza metoda to metoda SAGE (seryjna analiza ekspresji genów). Jest to metoda, w której na początku potrzebujemy próbkę mRNA. mRNA jest przetwarzane przez odwrotną transkryptazę do cDNA. Otrzymujemy dscDNA. Następnie trawimy preparat enzymem, który rozpoznaje sekwencję Alu. Po trawieniu otrzymujemy na końcu cDNA, która jest kompatybilna, komplementarna z linkerem. Linker ma ważną cechę, bo w nim jest umieszczona sekwencja rozpoznawana przez enzym restrykcyjny VF1 (chyba). Enzym jest enzymem restrykcyjnym drugiej klasy, typowym, tylko różni się tym, że trawi w odległości 10-14 nukleotydów, czyli w obrębie cDNA. Otrzymujemy odcinki o znanej długości, średniej koło 12 par zasad. Istotą tego co do tej pory się stało, jest to żeby otrzymać reprezentacyjne fragmenty, aby nie analizować całej sekwencji cDNA, tylko aby mieć krótkie fragmenty, żeby można je szybko poznać. Dalej, te uwolnione DNA, są obmywane ze złoża, następnie są ligowane za sobą i dostajemy długą strukturę, reprezentujące poszczególne transkrypty. Taki fragment jest sekwencjowany. Po tym mamy podzielone fragmenty, bo oddzielają je fragmenty enzymu restrykcyjnego. Po zsekencjonowaniu identyfikujemy transkrypty. Możemy też wyciągnąć wnioski o ilośc, lecz są to informacje względne. Kolejna…
… jest ciągi reszt C i G ,takie ciągi powtarzają się wielokrotnie i tworzą wyspye które nazywamy mianem wysp CTG. Mają one wyraźnie wiekszy udział niż przeciętna sekwencja i są zlokalizowane około 1000 par zasad od początku sekwencji i np. dla człowieka genomu stwierdzona od 40-50 % genów sąsiaduje z wyspami CTG i dla kręgowców jest charakterystyczny element genomu. Także jeżeli odnajduje…
… Intergenowe są bardzo krótkie tak że ten punkt informacyjny dodatkowy jest bardzo nieznaczący. Dlatego dla genomu prokariotycznego zwykły skaning wystarcza aby znaleźć właściwe sekwencje genu.
Przy genach eukariotycznych tworzą się przeróżne problemy. Przy schemacie gen eukariotyczny zawiera sekwencje intronowe i eksonowe , jeżeli gen zawiera jeden albo wiecej intronów to oczywiście on nie jest jedną ciągłą ramką odczytu i gdybyśmy po prostu wyszli właściwe trafiając w sekwencje tego eksonu ,z odczytem ramki i …?.bysmy go dalej wchodząc na sekwencje intronowi to co by się stało? Od razu pojawiłyby się jakieś sekwencje kodonu stopu i wniosek byłby błędny bo wnioskowalibyśmy że te sekwencje nie są sekwencjami genu. Do tego jeszcze dochodzi problem z długością intronów i eksonów ,wiele eksonów jest krótszych…
…. Pierwszy typ badań jest na górze schematu jest klasycznym sposobem badania. Mianowicie jest to konwencjonalna analiza genetyczna w której fenotyp jest na początku czyli mamy jakaś obserwacje np. morfologia organizmu czy budowa ,szlak biochemicznych cokolwiek jest zmienione i teraz od fenotypu identyfikujemy mutanty które temu fenotypowi odpowiadają ,na koncu jest znalezienie genu który jest odpowiedzialny…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)