Hydroliza enzymatyczna białka- sprawozdanie

Laboratorium biochemii
Hydroliza enzymatyczna białka (ćw H)
Cel ćwiczenia
Obserwacja i porównanie postępu reakcji hydrolizy białka katalizowanej przez naturalny zestaw trzustkowych enzymów proteolitycznych w obecności i nieobecności białkowego inhibitora,
Zapoznanie się z metodą oznaczania stężenia białek i peptydów- metodą Lowry'ego.
Odczynniki
0,15% roztwór pankreatyny (mieszanina enzymów proteolitycznych),
0,5% kazeina w 0,1M buforze fosforanowym o pH 7,8 - substrat,
0,08% roztwór wodny inhibitora sojowego,
0,1M bufor fosforanowy o pH 7,8,
5% kwas trój chlorooctowy (TCA),
Odczynnik miedziowy A (2% Na2CO3, 0,1M NaOH),
Odczynnik miedziowy B (0,5% CuSO4 ∙ 5H2O w 1% C6H5O7Na3 ∙ 2H2O),
Odczynnik Folina-Ciocalteu (produkt firmy SIGMA) .
Szkło i aparatura
Probówki chemiczne na 20 i 5 ml,
Probówki wirówkowe (plastikowe),
Pipety automatyczne i tipsy,
Cylindry miarowe,
Parafilm,
Kuwety,
Specol,
Termostat nastawiony na 37ºC,
Wirówka laboratoryjna UNIVERSAL 320.
Wykonanie ćwiczenia
Przygotowano 18 suchych i czystych probówek chemicznych. Podpisano je numerami od 1 do 14, a pozostałe 4 symbolami „E”, „E+I”, „P+W”, „P+I”.
Przygotowano 14 probówek wirówkowych. Podpisano je numerami od 1 do 14.
Do probówek wirówkowych dodano po 3ml 5% TCA.
Do probówek chemicznych „E” i „E+I” dodano po 7ml 0.5% kazeiny oraz po 7ml 0.1M buforu fosforanowego o pH 7.8
Do probówki chemicznej „P+W” dodano 2ml 0.15% roztworu pankreatyny i 2ml wody destylowanej.
Do probówki chemicznej „P+I” dodano 2ml 0.15% roztworu pankreatyny i 2ml 0.08% roztworu inhibitora sojowego.
Mieszaniny w probówkach chemicznych „E”, „E+I”, „P+W”, „P+I” dokładnie wymieszano i inkubowano w łaźni wodnej w 37 przez 5 min.
Po zakończeniu inkubacji zawartość probówki „P+W” przelano do probówki „E”, a zawartość probówki „P+I” przelano do probówki „E+I”
Probówki „E” i „E+I” zamknięto parafilmem i dokładnie wymieszano. Od tego momentu zaczęto mierzyć czas.
Po dokładnym wymieszaniu mieszanin z probówki „E” pobrano 2ml mieszaniny i dodano do probówki wirówkowej nr 1, natomiast 2ml mieszaniny pobranej z probówki chemicznej „E+I” przeniesiono do probówki wirówkowej nr8. Zawartość probówek wirówkowych dokładnie wymieszano.
Jednocześnie kontynuowano inkubację probówek chemicznych „E” i „E+I” w 37

(…)

…,
Doświadczenie pokazuje, że jak zakładaliśmy, inhibitor zmniejsza szybkość reakcji enzymatycznej,
Inhibitor sojowy działa jako inhibitor kompetencyjny i nie hamuje całkowicie reakcji enzymatycznej, ponieważ hamuje jedynie trypsynę i chymotrypsynę. W doświadczeniu użyliśmy mieszaniny enzymów proteolitycznych- pankreatynę, która dodatkowo zawiera również elastazę i karbosypeptydazę, na których aktywność inhibitor…
... zobacz całą notatkę