To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Biofizyka, wykład 8
Genom człowieka - 6 Gpz (wtf?, czemu nie 3,3 Gb? czy 3,3 Gb to haploidalny zestaw?)
da się ustalić sekwencję około 400 nukleotydowe, wiec genom człowieka trzebaby podzielić na 10 000 000 kawałków
WGS - whole genome shotgun
tnie sie restryktazami na przypadkowe kawałki, klonuje się w bakteriach I otrzymuje bibliotekę, potem się składa - kawałki te mają wspólne częsci - do składania wykorzystuje się zaawansowane techniki komputerowe
Sekwencjonowanie krótkich kawałków DNA:
chemiczna metoda Maxam-Gilberta (specyficzne z cięcie łańcucha oligonukleotydowego od końca 5' - selektywne cięcie na lewo od wybranej zasady
na końcu 5' sekwencjonowanego oligonukleotydu znakuje się fosforem radioaktywnym
nie widać po elektroforezie takich cząsteczek, które w wyniku cięcia zgubiły znakowany koniec
stosuje się żele rozdzielające oligonukleotydy z dokładnością do jednego nukleotydu
puszczamy żel w czterech liniach: G, A+G, T+C, C
odczytujemy od końca 5', czyli od dołu żelu (najkrótsze DNA)
trzeba zidentyfikować co jest pierwszym nukleotydem w inny sposób
sekwencjonowanie jednoranzowo do kilkudziesięciu nukleotydów
technika kontrolowanego przerwania replikacji (Sangera) - obecnie rutynowo stosowana, również zautomatyzowana
nie tnie się DNA, ale syntetyzuje
musimy uzyskać kawałki DNA różniące się o 1 nukleotyd
syntetyzujemy nić komplementarną na matrycy
wykorzystujemy polimerazę, warunki zautomatyzowane
polimeraza wymaga primera, jeśli tniemy restryktazami to są lepkie końce, które mogą być primerami
trzeba kilka nukleotydów określić na końcu 5' żeby zrobić primera
4 niezależne probówki, w każdej obok dNTPsów wprowadzamy modyfikowane nukleotydy - 2',3'-deoksynukleotydy - przyłączają się one do nowosyntetyzowanej nici, ale po ich przyłączeniu nie może już dojść do dalszej elongacji (brak grupy hydroksylowej przy węglu 3') - takich dideoksynukleotydów trzeba dodać około 1/100 tego, co nukleotydów zwykłych
otrzymujemy kawałki różnej długości kończące się na 2',3'-dideoksynukleotydach
każdy primer jest znakowany etykietą fluorescencyjną Przykład sekwenatora - ABI PRISM 3000, wykorzystuje elektroforezę kapilarną (1,6*10^5 nk/dobę, genom w ciągu roku)
Solexa - technika sekwencjonowania z wykorzystaniem superkomputerów i jednoczesnym składaniem wielu kawałków
technika z zastosowaniem szczypiec optycznych (trzymają matrycę i polimerazę) i obserwacja jak porusza się polimeraza przy niedoborze jednego z nukleotydów (jak brakuje jednego nukleotydu to jak polimeraza musi go włączyć to jest przestój i można to za pomocą odpowiednich technik zaobserwować) - trzeba przeprowadzić 4 reakcje
(…)
… (dupleksy)
helisy potrójne (tripleksy)
helisy poczwórne (tetrapleksy, kwadrupleksy)
pętle (róznego typu, np.: szpilka do włosów)
Helisy można przypisać do rodzajów (helisy klasyczne, kanoniczne, regularne - analizując helisy we włókanch nie udało się wejść w szczegóły, więc w modelach każdy nukleotyd jest opisany przez jeden zestaw kątów dwuściennych):
A
B
Z
Modele zaproponowane na podstawie badań…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)