To tylko jedna z 2 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Inne markery - negatywna selekcja (czyli poszukiwanie komórek, które straciły plazmid)
Normalne komórki z genem can1+ są wrażliwe na kanawalię - nie rosną na podłożu z kanawaliną
Jeśli wytniemy gen can1 (będzie mutant can1-) nabierają oporność i rosną.
Jeśli stworzymy mutanta z wyciętym genem i wprowadzimy gen na plazmidzie to nie rośnie na kanawalinie.
Natomiast mutant, który pogubił plazmidy rośnie na kanawalinie (np. jak wiele razy przesiewamy).
Gen S. cerevisiae CAN1 (S. pombe can1+) koduje permeazę arginina/histydyna
16.2 Screening kontra selekcja:
Screening- badamy wiele mutantów i szukamy tylko tych właściwych, mało czuła metoda
Selekcja- tylko interesujące nas mutanty przeżywają, bardzo czuła metoda.
16.3 Poszukiwanie (screening) mutacji dominujących lub związanych z utratą funkcji danego genu:
Niekiedy zwiększenie liczby kopii danego genu może spowodować pojawienie się fenotypu mutanta.
Nadekspresja zazwyczaj uzyskiwana jest przy użyciu - HIGH-COPY LIBRARY (w których cDNA ulega ekspresji pod kontrolowanym promotorem) lub BIBLIOTEKI GENOMOWEJ (zwiększenie liczby kopii episomu w stosunku do chromosomu). W przypadku BIBLIOTEKI GENOMOWEJ interesujący nas gen jest już wklonowany i może być zidentyfikowany poprzez izolację plazmidu z komórki drożdżowej, częściowe zsekwencjonowanie i porównanie z bazami danych.
Fenotypy poszukiwane w czasie nadekspresji różnią się od fenotypów otrzymywanych przy pozbawieniu funkcji danego genu: S. cerevisiae nadekspresja genów cyklu komórkowego powoduje zatrzymanie w konkretnym punkcie podziału co umożliwia zidentyfikowanie wielu nowych genów, które wcześniej nie były powiązane z cyklem komórkowym. Metoda ta może być także stosowana w analizach funkcji wcześniej sklonowanych genów, poprze mutagenezę it in vitro i poszukiwanie mutantów, które mają fenotyp DOMINANT-NEGATIVE 17. Określanie powiązań genetycznych:
Nawet u tak dobrze zbadanych organizmów jakimi są drożdże pozostało jeszcze wiele procesów, które nie zostały poznane pod względami genetycznymi
Mutanty pozwalają na rozpoczęcie badań powiązań genetycznych i zidentyfikowanie innych genów danego (badanego) szlaku lub innych szlaków które mają wpływ na interesujący nas proces
Metody te oparte są na SYNTETHIC INTERACTIONS pomiędzy różnymi mutacjami i są obecnie bardzo często wykorzystywane.
Istnieją 2 możliwości określenia powiązań genetycznych:
1) Analiza supresji- próba zachowania fenotypu oryginalnej mutacji przez wprowadzenie innej mutacji lub przez zwiększenie liczby kopii danego genu.
2) Poszukiwanie sztucznego wzmocnienia:
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)