MIKROBIOLOGIA ĆWICZENIE Barwienie drobnoustrojów Bakterie posiadają małą zdolność załamywania promieni świetlnych, dlatego są słabo widoczne w zwykłym mikroskopie świetlnym. Ich obserwacja jest możliwa dopiero po wybarwieniu. Barwniki są związkami chemicznymi zdolnymi do reagowania z barwionymi substancjami, dając trwałe, barwne połączenia. Większość barwników używanych w mikrobiologii to aniliny, pochodne benzenu. W cząsteczkach tych związków wyróżniamy grupę chromoforową (barwną) (np. grupy – azo, -nitrozo, -azoksy, tiokarbonylową) i grupę auskochromową zdolną do tworzenia soli z barwionym substratem (np. grupy –NH2, -OH). np. chlorek błękitu metylenu = błękit metylenu+ + Cl- Jeżeli chromofor jest jonem dodatnim, barwnik nazywamy zasadowym (błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fiolet goryczkowy, fuksyna zasadowa). W barwnikach kwaśnych chromofor jest jonem ujemnym (eozyna, fuksyna kwaśna, nigrozyna). Wyróżniamy następujące sposoby barwienia bakterii: a) proste, w których preparat barwi się przy pomocy jednego barwnika i wszystkie bakterie są zabarwione podobnie b) barwienie złożone, w których używa się wielu barwników i bakterie reagują na różne barwniki w innych sposób 1. Barwienie proste Barwienie pozytywne polega na zabarwieniu w preparacie komórek drobnoustrojów, zaś barwienie negatywne opiera się na uwidocznieniu otoczenia, nie zaś obiektu. W dobrze wybarwionym preparacie „pozytywnym” będziemy obserwować obiekt na jasnym tle, natomiast w preparacie „negatywnym” wybarwia się tło, a komórki pozostają jasne. 1.1 Barwienie proste pozytywne Przed rozpoczęciem barwienia należy przygotować i utrwalić preparat. Preparat wykonuje się poprzez rozprowadzenie zawiesiny bakterii na szkiełku podstawowym, które następnie suszy się na powietrzu. Utrwalenia materiału dokonuje się za pomocą czynników fizycznych (ogrzewanie szkiełka z suchym preparatem w płomieniu palnika gazowego, umieszczenie w temp. 60oC przez 10 min) lub chemicznych (alkohol etylowy, metylowy, formalina, pary kwasu osmowego). Utrwalenie materiału ma na celu zabicie obecnych w nich mikroorganizmów, a tym samym ułatwienie wnikania barwnika do ich wnętrza. Utrwalenie powoduje denaturacje enzymów bakteryjnych, co zapobiega rozkładaniu przez nie struktur komórkowych tzw. autolizie. Utrwalenie zwiększa
(…)
…. Wykonaj rozmaz i obserwacje według punktów 2-4
9. Wytrzyj olejek immersyjny z obiektywu
2. Barwienie złożone
2.1. Barwienie metodą Grama
Barwienie metodą Grama jest barwieniem złożonym, różnicującym, które w praktyce pozwala na
identyfikacje i klasyfikacje bakterii na Gram-dodatnie i Gram-ujemne. Barwienie Grama zostało
opracowane przez Krystiana Grama w 1884 roku, kiedy podczas prób wybarwienia bakterii
zauważył, że niektóre z nich tracą kolor, przy próbach wypłukania nadmiaru barwnika.
Technika barwienia Grama składa się z następujących czynności:
1. Barwienie podstawowe roztworem fioletu krystalicznego. Wszystkie bakterie zostają
wybarwione na fioletowo pod wpływem tego barwnika zasadowego.
2. Utrwalenie płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu). Jodyna w połączeniu z fioletem
krystalicznym tworzy…
… pożywki przy jej kontakcie z ezą, oznacza że ma zbyt wysoką
temperaturę; wysterylizuj ezę jeszcze raz i zacznij od początku. Rozprowadź
równomiernie komórki w kropli wody; rozmaz powinien wyglądać jak rozcieńczone
mleko; po przygotowaniu rozmazu ponownie wysterylizuj ezę
b) w drugim okręgu przygotuj rozmaz Bacillus megaterium; nie używaj wody,
ponieważ bakterie są już zawieszone w płynie; zamieszaj…
… nie rozlała się na szkiełku
2. Używając brzegu drugiego szkiełka podstawowego, rozprowadź kroplę po powierzchni
szkiełka, tak by uzyskać rozmaz o różniej grubości (w skali od czarnego do szarego);
grubość rozmazu będzie zależeć od kąta ustawienia szkiełka podczas rozprowadzenia
preparatu
3. Pozostaw preparat do całkowitego wyschnięcia; nie należy utrwalać preparatu przy
pomocy podgrzewania
4. Przeprowadź…
… w komórkach kompleksy krystaliczne fiolet-jodyna.
3. Odbarwienie (alkohol etylowy, lub mieszanina alkohol etylowy-aceton). Pierwotne
barwienie fioletem krystalicznym zostaje wymyte u niektórych bakterii, inne pozostają
zabarwione.
4. Dobarwienie barwnikiem kontrastowym (fuksyna karbolowa, safranina). Ten barwnik
zasadowy powoduje ponowne wybarwienie na czerwono (safranina) lub na różowo
(fuksyna) bakterii…
… fiolet-jodyna (jod zastępuje w cząsteczce atomy
chloru). U bakterii Gram-ujemnych czynnik odbarwiający (etanol) rozpuszcza warstwę plastyczną
ściany komórkowej, poprzez wypłukanie z niej fosfolipidów, i kryształy wymywane są poprzez
cienką warstwę peptydoglikanu. Ściana bakterii Gram-dodatnich po wpływem etanolu zostaje
dodatkowo uszczelniona. Alkohol działając na wiele warstw peptydoglikanu powoduje…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)