Analiza chemiczna biomoleku-fluorescencja

FLUORESCENCJA Energia wzbudzenia czasteczki moe zostac wykorzystana do pokonania bariery aktywacji w procesie fotochemicznym. Najczesciej zdarza sie jednak, e zostaje ona oddana, a czasteczka wraca do swojego stanu podstawowego. Jednym ze sposobów dezaktywacji wzbudzonych stanów elektronowych jest emisja fotonu. W przypadku, gdy jest ona nastepstwem absorpcji swiatła mamy do czynienia z fotoluminescencja. W zalenosci od rodzaju stanu wzbudzonego, z którego nastepuje emisja, wyrónia sie fluorescencje i fosforescencje. Fluorescencja jest szybkim procesem fotofizycznym, zachodzącym w czasie ~10-8 s. Ponieważ bezpromienista dezaktywacja wyższych stanów oscylacyjnych wzbudzonego stanu elektronowego zachodzi jeszcze szybciej (ok. 10-12 s), fluorescencje obserwuje się jedynie z najniższego oscylacyjnego poziomu pierwszego elektronowego stanu wzbudzonego. W przeciwieństwie do znacznie wolniejszego procesu fosforescencji, fluorescencja nie pociąga za sobą zmiany multipletowości. Podobnie jak w przypadku absorbancji, intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do steenia substancji emitujacej (w zakresie niskich steen; dla wysokich steen charakterystyczne jest zjawisko autowygaszania). Zależność ta ma postać: FLUORESCENCJA ZWIAZKÓW BIOLOGICZNIE CZYNNYCH. Substancjami wykazujacymi zjawisko fluorescencji wsród zwiazków biologicznie czynnych sa miedzy innymi: • Aminokwasy aromatyczne: tryptofan, tyrozyna, fenyloamina • Zasady nukleinowe w DNA i RNA: adenina, guanina, cytozyna, tymina, uracyl • Barwniki roślinne: chrofile, bakteriochlorofile i karotenoidy • Witaminy i hormony: np. ryboflawina WYKORZYSTANIE FLUORESCENCJI DO OKRESLANIA ELEMENTÓW STRUKTURALNYCH BIAŁEK. Spektroskopia fluorescencyjna jest metoda często stosowana w badaniach białek. Z analizy widm fluorescencyjnych danej cząsteczki białkowej oraz z ich zależności od różnych czynników środowiskowych (takich jak pH, temperatura, lepkość) mona wyciągnąć szereg ciekawych wniosków np. na temat struktury przestrzennej białka czy oddziaływania z innymi cząsteczkami. Białka zawdzięczają swoje właściwości fluorescencyjne obecności w łańcuchu polipeptydowym aromatycznych aminokwasów – tryptofanu, tyrozyny i fenyloalaniny. Ich fluorescencja przypada na zakres bliskiego ultrafioletu. Maksimum absorpcji dla fenyloaminy to 260 nm, a emisji- 282 nm. Dla tyrozyny następuje przesuniecie w stronę niższych energii, maksimum absorpcji przypada na długość fali 275 nm, a emisji 304 nm. Widma absorpcji tryptofanu przesunięte są w jeszcze bardziej długofalowa cześć UV. Maksimum absorpcji dla tryptofanu to 295 nm, a emisji 353 nm. Wydajności kwantowe tryptofanu i tyrozyny są zbliżone (odpowiednio 0,13 i 0,14) i kilkakrotnie wysze ni ... zobacz całą notatkę