Kultury Komórkowe i Tkankowe - część zwierzęca
DŁUGOTERMINOWE PRZECHOWYWANIE KULTUR ZWIERZĘCYCH
Ćwiczenie 1 - ZAMRAŻANIE I ROZMRAŻANIE KOMÓREK ZWIERZĘCYCH
Krioprezerwacja - proces przechowywania materiału biologicznego w temperaturze między -79 a -196oC. W temperaturze poniżej -130 oC ustają procesy biochemiczne, natomiast w temperaturze -196 oC ustają procesy metaboliczne.
Kultury komórkowe in vitro są zamrażane i przechowywane w bankach komórek, zwykle w ciekłym azocie w temperaturze -196 oC. Przechowywanie kultur w stanie zamrożenia zmniejsza ryzyko zakażenia mikrobiologicznego i zanieczyszczenia kultury komórkami innych linii, ogranicza zmiany w materiale genetycznym, zmniejsza ryzyko różnicowania fenotypowego komórek oraz redukuje koszty związane z ciągłym utrzymywaniem komórek w hodowli. Dzięki bankowi komórek zapewniony jest stały dostęp do materiału biologicznego, w razie jego utraty. Ponadto, w przypadku linii komórkowych o określonej liczbie generacji czy pasaży, zamrożona pula komórek o niskim pasażu, gwarantuje wykonywanie badań na komórkach o wysokim potencjale proliferacyjnym i zawsze w tym samym pasażu (wieku).
Najbardziej znanymi i największymi kolekcjami na świecie są: Europejska Kolekcja Zwierzęcych Kultur Komórkowych - ECACC, (ang. European Collection of Animal Cell Cultures) i Amerykańska Kolekcja Hodowli Komórkowych - ATCC (ang. American Type Culture Collection). Banki te zawierają wiele linii komórkowych pochodzących z tkanek wielu gatunków zwierząt, w tym wiele linii wyprowadzonych z prawidłowych oraz nowotworowych tkanek ludzkich. Wszystkie dostępne w kolekcjach linie przechodzą testy jakościowe oraz procedury identyfikacyjne. Zapewnia to wysoką jakość oraz czystość komercyjnie dostępnych linii komórkowych. Ponadto, do każdej zakupionej hodowli dołączony jest szczegółowy opis danej linii komórkowej (pochodzenie, morfologia, kariotyp, pasaż, wymagania wzrostowe, wrażliwość na infekcje wirusami).
Zamrażaniu powinny być poddawane tylko kultury „zdrowe” niezainfekowane mikroorganizmami, o wysokiej żywotności powyżej 95%, będące w logarytmicznej fazie wzrostu, w przypadku komórek adherentnych tzw. kultury semikonfluentne. Optymalna gęstość zamrażanej zawiesiny komórek powinna wynosić 106-107 komórek/ml. Różne procedury zamrażania i rozmrażania komórek mogą być stosowane w różnych laboratoriach, lecz podstawową zasadą, która musi być spełniona podczas tych procedur jest zasada powolnego zamrażania i szybkiego rozmrażania komórek. Szybkość zamrażania powinna być optymalna - na tyle niska by dochodziło do powolnej dehydratacji komórek i na tyle duża by zabezpieczyć komórki przed uszkodzeniami wynikającymi z dehydratacji. Zbyt szybkie odwodnienie komórek może powodować wytrącanie zagęszczonych składników cytoplazmy, wypadanie jonów, zmiany pH, wysalanie białek oraz wiele innych zjawisk niekorzystnych dla funkcjonowania komórki. Doświadczalnie wykazano, że szybkość obniżania temperatury podczas mrożenia powinna wynosić ok. 1
(…)
… ze zmagazynowanych w adipocytach triacylogliceroli)
rola immunomodulująca - aktywność endo- i parakrynna • endokrynna: leptyna, adiponektyna, angiotensynogen, rezystyna, estrogeny, czynnik martwicy guzów TNF-α, receptor aktywujący proliferację peroksysomów γ (PPARγ), interleukina 6 (IL-6), insulinopodobny czynnik wzrostu 1 IGF-1, białka zakłócającego proces oksydacyjnej fosforylacji • parakrynna: lipaza…
… trypsynę,
- Odseparować komórki przez wirowanie,
- Osad komórkowy zawiesić w schłodzonej surowicy, w ilości równej połowie objętości końcowej, komórki umieścić w łaźni lodowej,
- Do zawiesiny komórek dodać schłodzoną surowicę z 20% dodatkiem DMSO (DMSO w temperaturze pokojowej jest toksyczny dla komórek). Ilość surowicy z DMSO jest równa objętości zawiesiny komórek.
Zawiesinę komórek z krioprotektantem…
… i 5% CO2. 5. Przez 2-3 godziny monitorować proces adhezji komórek do powierzchni naczynia,
6. Po przyczepieniu komórek wymienić pożywkę na świeżą.
PASAŻOWANIE I UTRZYMYWANIE W HODOWLI KULTUR KOMÓRKOWYCH
Ćwiczenie 2 - Pasażowanie komórek linii HeLa
PASAŻOWANIE
Kiedy kultura komórkowa staje się konfluentna, czyli komórki zaczynają pokrywać całą dostępną powierzchnię wzrostu lub ich gęstość w zawiesinie…
… aby mogły rosnąć i proliferować. Pierwszym etapem tworzenia hodowli jest ich adhezja do powierzchni, która odbywa się dzięki receptorom dla cząsteczek substratu obecnym na powierzchni komórek. Okrągłe początkowo komórki rozpłaszczają się i przybierają charakterystyczny wygląd. Rozpłaszczanie zaczyna się w momencie wydzielania przez komórki specjalnych białek i proteoglikanów wchodzących w skład matriks…
… i wiążących jony Ca2+ i Mg2+ np. EDTA oraz strawić warstwę powlekającą, która warunkuje przyczepianie komórek używając trypsyny lub kolagenazy. Podczas odklejania komórki stają się ponownie okrągłe i stopniowo odrywają się od dna naczynia hodowlanego. Traktowanie enzymami nie powinno trwać za długo ponieważ może dojść do zniszczenia błon komórkowych. Z drugiej strony przy zbyt krótkim czasie trypsynizacji…
… się niewielką zawartością cytoplazmy, bowiem większość ich stanowi kropla tłuszczu - głównie triglicerydy, które są rozkładane na glicerol i wolne kwasy tłuszczowe. Na poziomie komórkowym otyłość określamy jako wzrost liczby i wielkości adipocytów w procesie różnicowania z preadipocytów. Rozwój tkanki tłuszczowej wynika ze wzrostu rozmiarów adipocytów po nadmiernej akumulacji kwasów tłuszczowych…
… genetyczne w kierunku różnicowania w dojrzałe adipocyty. Po około 5-8 dniach od indukcji różnicowania 90% komórek wykazuje fenotyp charakterystyczny dla dojrzałych adipocytów, kumulujących wewnątrz komórki krople tłuszczu . To przejście od stanu komórki niedojrzałej do stanu czynnościowego adipocytu można ocenić morfologicznie, poprzez wykazanie obecności wewnątrzcytoplazmatycznych pęcherzyków gromadzących…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)