Laboratorium biochemii
Kinetyka enzymatyczna I (ćw. A)
Cel ćwiczenia
Wyznaczenie podstawowych parametrów kinetycznych dla kwaśnej fosfatazy poprzez pomiar ilości powstałego produktu,
Ustalenie czy kwaśna fosfataza stosuje się do kinetyki Michaelis'a-Menten, Obliczenie stałej Michaelis'a, szybkości maksymalnej oraz stałej szybkości reakcji.
Odczynniki
0.25 M bufor octanowy o pH. 5.0
0.5 M wodorotlenek sodu
5 mM roztwór standardowy p-nitrofenolu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0
5 mM roztwór p-nitrofenylofosforanu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0
Roztwór fosfatazy kwaśnej z ziemniaka w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0, Ce° = 0.08 mg/ml
Szkło i aparatura
probówki chemiczne
kolba ad 10 ml
pipety automatyczne oraz tipsy
kuwety
Specol
termostat nastawiony na 37°C
Wykonanie ćwiczenia
Pomiar szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu:
Do 21 probówek dodano w ilościach zadanych w Tabeli 1:
0.25 M buforu octanowego o pH 5.0 5.0 mM p-nitrofenylofosforan,
Roztwory inkubowano przez 5 min w łaźni wodnej o temperaturze 37°C,
Po czasie inkubacji do nieprimowanych probówek dodano roztwór fosfatazy,
Próby 1-11 inkubowano w 37°C przez 25 min.,
Po upływie czasu do wszystkich próbek dodano po 2 ml 0.5M roztworu NaOH,
Zmierzono absorbancję roztworów przy λ=410 nm względem próby 11.
Krzywa standardowa
Otrzymany roztwór p-nitrofenolu rozcieńczono 50-krotnie w kolbie miarowej o pojemności 10 ml. Otrzymany roztwór dokładnie wymieszano i przelano do
probówki „P”,
Do 8 suchych probówek dodano w ilościach zadanych w Tabeli 2. :
0.25 M bufor octanowy o pH 5.0, 0.1mM p-nitrofenol, 0.5 M NaOH Zmierzono absorbancję przy λ=410 nm dla sporządzonych roztworów wobec odnośnika - próbki 8.
Obliczenia i wyniki
(…)
… otrzymujemy Wykres 3. z R = 0,935. Wykres 3. - Wykres zależności Vc = f([S]), uwzględniający odrzucone punkty. Wykres 4. - Lineweavera - Burka Ponownie odrzucamy błędne pomiary jakimi są próbki 6 i 9. Po odrzuceniu otrzymujemy Wykres 5. z R = 0,981. Wykres 5. - Lineweavera - Burka , uwzględniający odrzucone punkty.
Równanie wykresu : Obliczanie stałej Michaelisa (Km), szybkości maksymalnej (Vmax): V = stąd…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)