Cytometria

1 Regulacja cyklu komórkowego – część pierwsza Wykład 5 Cykl komórkowy – proces podziału komórki  macierzystej na dwie potomne Mitoza Synteza DNA M S G1 G2 Przerwa 1 (Gap 1) Przerwa 2 (Gap 2) G0 Zatrzymanie podziałów  i końcowe różnicowanie  lub wejście w stan spoczynku Mitoza: profaza, metafaza, anafaza, telofaza Interfaza: G1, S, G2 Punkty kontrolne cyklu komórkowego - checkpoints G1 S G2 M Wielkość komórki Uszkodzenia DNA Zaburzona replikacja Uszkodzenia DNA Wielkość komórki Uszkodzenia DNA Zaburzenia ułożenia chromosomów G1/S intra-S lub replikacyjny G2/M metafaza/ anafaza Punkt START Punkt restrykcyjny Drożdże rozszczepkowe Schizosaccharomyces pombe Drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae Organizmy modelowe do badań nad cyklem  komórkowym Jeżowiec morski Arbacia Komórki ludzkie 2 godziny 16 godzin 2,5 godziny 2 Cytometria przepływowa Cytometria przepływowa  to metoda pomiaru  pojedynczych komórek lub cząsteczek  przepływających przez aparat w strumieniu cieczy Przepływ komórek i układ pomiarowy Parametry mierzalne za pomocą  cytometru przepływowego •  STRUKTURALNE  rozmiar, kształt, cytoplazmatyczna ziarnistość, zawartość barwnika np.: hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne, porfiryny, aminokwasy fluoryzujące w białkach np.:tryptofan, tyrozyna, zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów, cukrów powierzchniowych, antygenów •  FUNKCJONALNE ładunek powierzchniowy, ekspresja receptorów powierzchniowych, integralność błony (żywotność), aktywność endocytarna, organizacja cytoszkieletu, aktywność enzymów WIELOPARAMETROWA  ANALIZA Do analizy i obrazowania danych stosuje  się kilka typów wykresów : jednowymiarowe (histogram),  dwuwymiarowe (kropkowy) 3 G0-G1 G0-G S G2-M G2 intensywność fluorescencji intensywność ilo ść  komóre k Histogram DNA WYKRES DWUWYMIAROWY  (KROPKOWY) •  PI – jodek propidyny – barwi DNA martwych  komórek •  Aneksyna- FITC  (fluoresceina)  –łączy się  z fosfatydyloseryną obecną w na zewnątrz  błony komórek  apoptotycznych komórki apoptotyczne komórki żywe komórki martwe aneksyna V-FITC • FL1-H • FL2 -H PI Replikacja genomu Tworzenie wrzeciona  Segregacja chromosomów Koniec mitozy Decyzja o podziale G1 S G2 M G1 G1 1N 2N 1N 2N 1N 2N 1N 2N 1N 2N Decyzja o podziale Ilość DNA G1 S G2 1N  2N G1 S G2 Lic zba komó rek Poziom fluorescencji 4 Sposoby na synchronizacje komórek w  jednej fazie cyklu komórkowego • Faza G1: feromon alfa (u  S. cerevisiae)  lub głodzenie (u  S. pombe) • Faza S: hydroksymocznik, zahamowanie  ... zobacz całą notatkę