Wykonanie oznaczenia spektrofotometrycznego

Wybór długości fali i stężeń roztworów wzorcowych

W spektrofotometrii ilościowej przed przystąpieniem do pomiarów należy zastanowić

się nad:

• wyborem analitycznej długości fali,

• doborem odpowiednich stężeń substancji oznaczanej,

• metodą pomiaru.

Pomiary wykonane przy lmax odznaczają się największą dokładnością i czułością. Przy

lmax wartość DA jest znacznie większa niż przy lmin. Pomiar absorbancji wykonuje się

napełniając kuwetę pomiarową roztworem próbki badanej, a kuwetę odniesienia odnośnikiem,

którym jest najczęściej rozpuszczalnik (w metodach bezpośrednich) lub ślepa próba

(w metodach pośrednich). Metody bezpośrednie oparte są na selektywnej absorpcji

oznaczanego składnika, a metody pośrednie - na pomiarze absorbancji dopiero

po spowodowaniu absorbcji, której wartość jest proporcjonalna do stężenia oznaczanego

składnika. Ślepa próba jest to oznaczenie wykonane w identycznych warunkach ale

bez substancji oznaczanej, w celu kompensowania błędów spowodowanych absorpcją

pochodzącą od odczynników lub innych składników próbki niż oznaczany. Jeżeli ślepa próba

wykazuje znaczną absorpcję, to jako analityczną długość fali wybiera się nie lmax lecz długość

fali, przy której wpływ ślepej próby jest mały.

Przygotowując robocze roztwory wzorcowe przez rozcieńczenie wzorcowego

roztworu podstawowego, najkorzystniej jest tak dobrać ich stężenia, aby otrzymać optymalny

dla danego spektrofotometru zakres wartości mierzalnej absorbancji.

Analiza układów wieloskładnikowych

Aby oznaczyć dwa składniki występujące równocześnie w badanym układzie,

musi on spełniać:

• prawo Beera w wybranym zakresie długości fali i stężeń,

• prawo addytywności absorbcji,

• warunek, że układ krzywych spektrofotometrycznych obydwu składników musi umożliwiać

wybór dwóch długości fali, przy których raz dominuje absorbancja jednego składnika, a raz

drugiego, • warunek braku innych substancji absorbujących.

Na ogół liczba analitycznych długości fali musi być co najmniej równa liczbie

oznaczanych składników, tak aby można było ułożyć układ równań. Warunek rozbieżności

krzywych absorpcji wymaga, aby stosunek molowych współczynników absorpcji pierwszego

i drugiego składnika był znacznie większy przy pierwszej długości fali niż przy drugiej