Badanie składu białka

Okreslanie składu aminokwasowego i sekwencji

Białko rozszczepiane jest chemicznie lub enzymatycznie na mniejsze peptydy, które są rozdzielane i analizowane różnymi metodami

Hydroliza białka do składowych aminokwasów: warunki klasyczne: 6 M HCl zawierający 0,1% fenol, w próżni lub atmosferze azotu, w zamkniętej ampułce, 110oC, 18 – 96 h

Problemy i ograniczenia:

częściowa destrukcja reszt Ser, Thr, Tyr.

Zakłada się 10% destrukcję Ser oraz 5% destrukcję Thr i Tyr w ciągu 24 h, lub przeprowadza się hydrolizę trzech próbek, odpowiednio przez 24, 48 i 72 h i następnie ekstrapoluje się wyniki dla momentu zero

- reszty Asn i Gln są przekształcane w Asp i Glu.

- rozwiązaniem jest traktowanie białka bis-(1,1-trifluoro-acetoksy)jodobenzenem /36 mg/ml w

0.01 M TFA, 4 h, 60 °C, w ciemności/. W tych warunkach reszty karboksyamidowe są przekształcane w aminy

-całkowita destrukcja Trp. Konieczne przeprowadzenie osobnej hydrolizy. Warunki: 3 M kwas ptoluenosulfonowy,

110 °C, 24 – 72 h, w próżni

Metoda sekwencjonowania w spektrometrze mas pozwala na okreslenie sekwencji aminokwasowej peptydów o długosci do około 30 aminokwasów

Podczas sekwencjonowania peptydu w spektrometrze mas nie mozna odróznic aminokwasów: leucyny od izoleucyny oraz lizyny od glutaminy.

Leucyna i izoleucyna maja identyczne masy molowe, gdyz sa swoimi izomerami. Lizyna i glutamina pomimo innego składu pierwiastkowego maja bardzo podobne masy. Stosuje sie wiec analize Edmana i spektrometrie mas